我们的工作通过工程肌动蛋白和微管的复合材料，使细胞骨架重建工作更接近模拟细胞条件的重要一步，由驱动蛋白和肌球蛋白马达驱动，以主动调整，重组和移动。我们的复合材料的动力学和结构可以通过独立添加、移除和调整不同的组件来精确编程，以表现出丰富的收缩、感染、脱模、粗化和破裂相基。我们的方法广泛适用于设计、创建和表征活性物质平台，这些平台包含多个力产生组件，这些组件作用于单个系统中的不同基板。
演示该程序的将是Daisy Achiriloaie和Maya Hendija。我们实验室的本科研究人员。首先，使用微量移液器和无菌移液器吸头将试剂添加到无菌黑色1.5毫升微量离心管中，以形成驱动蛋白运动簇，在微管对之间结合并施加力。
通过上下移液轻轻混合溶液。然后将溶液在4摄氏度下孵育30分钟，避光。要制备由Acton细丝和微管组成的共缠缠复合网络，请将加热块设置为37摄氏度。
将试剂加入无菌0.6毫升微量离心管中。确保总体积为 25 微升。轻轻地上下移液以混合，然后将其放在避光的37摄氏度加热块上一小时。
之后，从加热块中取出管子，并使用微量移液管轻轻混合 0.84 微升 100 微摩尔鬼笔环肽。在室温避光下孵育 5 至 10 分钟。为了制备用于焦点成像的活性复合材料，将试剂添加到溶液中，并通过上下移液轻轻混合。
将溶液分成三个 10 微升等分试样，并将它们标记为 K、K 加 M 和阴性对照。在K加M等分试样中加入2.54微升肌球蛋白，在K和阴性对照等分试样中加入2.54微升PEM。然后将 2.5 微升驱动蛋白簇加入 K 和 K 以及 M 等分试样中，上下移液混合。
接下来，使用相同的技术向阴性对照中加入2.5微升PEM。使用微量移液器通过毛细管作用将每种溶液缓慢流入样品室的相应通道。非常缓慢和轻轻地向下推移液器，以免将气泡引入通道。
用快干环氧树脂或紫外线固化胶密封每个通道的两个开口端。当粘合剂完全干燥时，将通道放在显微镜上，使复合材料成像尽可能接近初始非活性状态。首先对K通道和K加M通道进行成像，然后对控制通道进行成像。
请注意从将驱动蛋白簇添加到 K 和 K 加上 M 等分试样到开始数据采集之间经过的时间。要将肌动蛋白制备为肌动蛋白或 AA 交联剂，请将生物素-肌动蛋白、中性亲和素、生物素和 PEM 添加到微量离心管中，并通过上下移液轻轻混合。同样，对于微管到微管或MM交联剂，将生物素-微管蛋白，中性亲和素，生物素和PEM添加到微量离心管中，并通过上下移液轻轻混合。
将管子包裹在热塑性天花板薄膜中以形成防水密封，并将它们放入浮选筏中，置于温度受控的 sonicater 浴缸中，设置为 4 摄氏度，持续 90 分钟。要将A-A交联剂复合物掺入样品中进行成像，请将试剂添加到微量离心管中。确保总体积为 25 微升。
同样，对于M-M交联剂复合物，将屏幕上显示的试剂添加到微量离心管中。通过上下移液混合溶液，并将其放在避光的 37 摄氏度加热块上一小时。之后，从加热块中取出管子，并使用微量移液管混合0.84微升100微摩尔鬼笔环肽。
在室温下避光孵育5至10分钟，并重复前面所示的程序以制备用于共聚焦成像的活性复合材料。肌动蛋白单纤维和微管蛋白二聚体共聚合形成肌动蛋白丝和微管的共缠结网络。肌球蛋白两个迷你丝和驱动蛋白簇推拉细丝，使复合材料脱离稳定状态。
使用NeutrAvidin连接生物素化的肌动蛋白丝或微管来实现被动交联。肌球蛋白两个迷你丝，驱动蛋白簇或两个电机被掺入没有被动交联，肌动蛋白 - 肌动蛋白交联和微管 - 微管交联的复合材料中。此处显示了具有不同肌球蛋白浓度和摩尔肌动蛋白分数的肌球蛋白驱动的细胞骨架复合材料的两种颜色共聚焦成像。
粒子图像测速显示，肌动蛋白肌球蛋白活性触发了共纠缠复合材料中肌动蛋白和微管的协调收缩动力学。在这里，不同的箭头颜色对应于不同的速度，如矢量场右侧的色阶所示。对时间序列的微管和肌动蛋白通道进行时间分辨差动态显微镜，以确定肌动蛋白和微管的衰变时间与波数的特征。
收缩速度通过拟合衰减时间曲线确定，该曲线在每个 45 分钟时间序列的整个持续时间内对所有滞后时间求平均值。时间分辨差分动态显微镜通过评估肌动蛋白和微管在45分钟激活时间内连续六分钟间隔的衰减时间，量化动力学如何随时间变化。肌动蛋白丝和微管的时间分辨收缩速度由拟合到相应的衰变时间曲线确定。
空间图像自相关分析通过比较实验开始时与实验结束时不同网络的自相关曲线来量化活性细胞骨架成分的运动驱动重组。通过自相关曲线的指数拟合确定的时间分辨相关长度显示了与实质性重组的复合材料相比，不会重组的复合材料。驱动蛋白驱动的肌动蛋白微管复合材料的两张彩色共聚焦图像显示，随着时间的推移，配方依赖性重组，没有交联剂复合材料重组为松散连接的富含微管的簇。
肌动蛋白-肌动蛋白交联支持肌动蛋白微管共定位，而微管-微管交联增强D混合。差分动态显微镜和空间图像自相关分析表明了交联和竞争的霉菌素和驱动蛋白电机对复合材料时变动力学和结构的影响。为了更紧密地模拟细胞条件，研究人员可以结合中间细丝、其他马达和控制细丝长度和刚度的结合蛋白。
还可以执行光镊计量测量来表征复合材料力学。使用我们的方法，研究人员可以在前所未有的相空间中精确调整细胞骨架启发的复合活性物质的动力学和结构，以模拟不同的细胞过程并设计可重新配置的可编程材料。
