Nosso trabalho traz os esforços de reconstituição do citoesqueleto um passo importante para mais perto de imitar as condições celulares através da engenharia de compósitos de actina e microtúbulos, impulsionados por motores de cinesina e miosina para sintonizar, reestruturar e mover ativamente. A dinâmica e a estrutura de nossos compósitos podem ser programadas com precisão, adicionando, removendo e ajustando independentemente os diferentes componentes para exibir uma rica base de fase de contração, infecção, desmatização, grosso e ruptura. Nossa abordagem é amplamente aplicável para projetar, criar e caracterizar plataformas de matéria ativa que incorporam múltiplos componentes geradores de força que atuam em diferentes substratos em um único sistema.
Demonstrando o procedimento estarão Daisy Achiriloaie e Maya Hendija. Pesquisadores de graduação do nosso laboratório. Para começar, adicione os reagentes a um tubo de microcentrífuga preto estéril de 1,5 mililitro usando uma micropipeta e pontas de pipeta estéril para formar aglomerados motores Kinesin que se ligam e exercem forças entre pares de microtúbulos.
Misture suavemente pipetando a solução para cima e para baixo. Em seguida, incube a solução por 30 minutos a quatro graus Celsius, proteja-a da luz. Para preparar uma rede composta co-emaranhada de filamentos de actão e microtúbulos, defina o bloco de calor para 37 graus Celsius.
Adicione os reagentes a um tubo de microcentrífuga estéril de 0,6 mililitros. Certifique-se de que o volume total é de 25 microlitros. Pipete suavemente a solução para cima e para baixo para misturá-la e colocá-la no bloco de calor de 37 graus Celsius protegido da luz durante uma hora.
Depois disso, remova o tubo do bloco de calor e use uma micropipeta para misturar suavemente em 0,84 microlitros de 100 micromolares faloidina. Incubar durante cinco a 10 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. Para preparar compósitos ativos para imagens focais, adicione os reagentes à solução e misture suavemente pipetando para cima e para baixo.
Divida a solução em três alíquotas de 10 microlitros e rotule-as como K, K mais M e controle negativo. Adicionar 2,54 microlitros de miosina à alíquota K mais M e 2,54 microlitros de PEM a K e alíquotas de controle negativo. Em seguida, adicione 2,5 microlitros de aglomerados Kinesin a K e K mais alíquotas M e pipeta para cima e para baixo para misturar.
Em seguida, adicione 2,5 microlitros de PEM ao controle negativo usando a mesma técnica. Use uma micropipeta para fluir lentamente cada solução para o canal correspondente das câmaras de amostra através da ação capilar. Empurre para baixo muito devagar e suavemente sobre a pipeta para não introduzir bolhas de ar no canal.
Sele as duas extremidades abertas de cada canal com epóxi de secagem rápida ou cola curável por UV. Quando o adesivo estiver completamente seco, coloque o canal no microscópio para obter a imagem do compósito o mais próximo possível do estado inativo inicial. Imagine o canal K e os canais K mais M primeiro seguidos pelo canal de controle.
Observe o tempo decorrido entre a adição dos clusters Kinesin às alíquotas K e K mais M e o início da aquisição de dados. Para preparar os reticuladores de actina para actina ou AA, adicione Biotina-Actina, NeutrAvidina, Biotina e PEM a um tubo de microcentrífuga e misture-os suavemente pipetando para cima e para baixo. Da mesma forma, para microtúbulos a microtúbulos ou reticulantes MM, adicione Biotina-tubulina, NeutrAvidin, Biotina e PEM a um tubo de microcentrífuga e misture-os suavemente pipetando para cima e para baixo.
Envolva o tubo em um filme de teto termoplástico para criar uma vedação estanque e coloque-os em uma jangada de flutuação em um banho de sonicater com temperatura controlada, ajustado a quatro graus Celsius por 90 minutos. Para incorporar complexos de reticulantes A-A em amostras para geração de imagens, adicione os reagentes a um tubo de microcentrífuga. Certifique-se de que o volume total é de 25 microlitros.
Da mesma forma, para complexos de reticulação M-M, adicione os reagentes mostrados na tela a um tubo de microcentrífuga. Misture a solução pipetando para cima e para baixo e coloque-a no bloco de calor de 37 graus Celsius protegido da luz durante uma hora. Depois disso, remova o tubo do bloco de calor e use uma micropipeta para misturar em 0,84 microlitros de 100 micromolares faloidina.
Incubar por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente protegida da luz e repetir o procedimento mostrado anteriormente para preparar compósitos ativos para imagens confocais. As monofibras de actina e os dímeros de tubulina são copolimerizados para formar redes co-emaranhadas de filamentos de actina e microtúbulos. Dois mini filamentos de miosina e aglomerados de cinesina empurram e puxam os filamentos para conduzir os compósitos para fora do estado estacionário.
A reticulação passiva é obtida usando NeutrAvidin para ligar filamentos de actina biotinilados ou microtúbulos. Miosina dois mini filamentos, aglomerados de cinesina ou ambos os motores são incorporados em compósitos sem ligações cruzadas passivas, ligações actina-actina e ligações cruzadas microtúbulo-microtúbulo. Duas imagens confocais coloridas de compósitos de citoesqueleto acionados por miosina com concentrações variáveis de miosina e frações de actina molar são mostradas aqui.
A velocimetria da imagem de partículas mostra que a atividade da miosina da actina desencadeia a dinâmica contrátil coordenada da actina e dos microtúbulos em compósitos coemaranhados. Aqui, diferentes cores de seta correspondem a diferentes velocidades, conforme indicado na escala de cores à direita dos campos vetoriais. A microscopia dinâmica diferencial resolvida no tempo é realizada em canais de microtúbulos e actina de séries temporais para determinar características de tempos de decaimento versus número de onda para actina e microtúbulos.
As velocidades de contração são determinadas através de ajustes para curvas de tempo de decaimento, calculadas em média em todos os tempos de atraso durante toda a duração de cada série temporal de 45 minutos. A microscopia dinâmica diferencial resolvida pelo tempo quantifica como a dinâmica varia ao longo do tempo, avaliando os tempos de decaimento por intervalos consecutivos de seis minutos durante o tempo de ativação de 45 minutos para actina e microtúbulos. As velocidades de contração resolvidas pelo tempo para filamentos de actina e microtúbulos são determinadas a partir de ajustes para curvas de tempo de decaimento correspondentes.
A análise de autocorrelação de imagem espacial quantifica a reestruturação motora de componentes citoesqueléticos ativos, comparando curvas de autocorrelação para as diferentes redes no início do experimento em comparação com o final. Os comprimentos de correlação resolvidos no tempo determinados por meio de ajustes exponenciais de curvas de correlação automática mostram compósitos que não se reestruturam em comparação com aqueles que se reestruturam substancialmente. Duas imagens confocais coloridas de compósitos de microtúbulos de actina acionados por Kinesin mostram a reestruturação dependente da formulação ao longo do tempo sem que os compósitos reticulantes se reestruturassem em aglomerados ricos em microtúbulos vagamente conectados.
A reticulação actina-actina suporta a co-localização de microtúbulos de actina, enquanto a reticulação microtúbulo-microtúbulo melhora a mistura D. A microscopia dinâmica diferencial e a análise de autocorrelação de imagem espacial mostram o efeito da reticulação e da competição de motores de micina e cinesina na dinâmica e estrutura variáveis no tempo dos compósitos. Para imitar as condições celulares mais de perto, os pesquisadores podem incorporar filamentos intermediários, outros motores e proteínas de ligação que controlam os comprimentos e rigidezes dos filamentos.
Medições de metrologia de pinças ópticas também podem ser realizadas para caracterizar a mecânica composta. Usando nossa abordagem, os pesquisadores podem ajustar com precisão a dinâmica e a estrutura da matéria ativa composta inspirada no citoesqueleto em um espaço de fase sem precedentes para emular diversos processos celulares e projetar materiais programáveis reconfiguráveis.
