Çalışmamız, sitoiskelet sulandırma çabalarını, aktif olarak ayarlamak, yeniden yapılandırmak ve hareket ettirmek için kinesin ve miyozin motorları tarafından tahrik edilen aktin ve mikrotübüllerin mühendislik kompozitleri tarafından hücresel koşulları taklit etmeye önemli bir adım daha yaklaştırıyor. Kompozitlerimizin dinamikleri ve yapısı, zengin bir büzülme, enfeksiyon, buğulanma, kabalaşma ve kopma faz tabanı sergilemek için farklı bileşenlerin bağımsız olarak eklenmesi, çıkarılması ve ayarlanmasıyla hassas bir şekilde programlanabilir. Yaklaşımımız, tek bir sistemde farklı substratlar üzerinde hareket eden çoklu kuvvet üreten bileşenleri içeren aktif madde platformlarını tasarlamak, oluşturmak ve karakterize etmek için geniş çapta uygulanabilir.
Prosedürü gösteren Daisy Achiriloaie ve Maya Hendija olacak. Laboratuvarımızdan lisans araştırmacıları. Başlamak için, mikrotübül çiftleri arasında bağlanan ve kuvvet uygulayan Kinesin motor kümeleri oluşturmak için bir mikro pipet ve steril pipet uçları kullanarak reaktifleri steril siyah 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin.
Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek, hafifçe karıştırın. Daha sonra çözeltiyi dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, ışıktan koruyun. Akton filamentleri ve mikrotübüllerinden oluşan bir eş dolaşık kompozit ağ hazırlamak için, ısı bloğunu 37 santigrat dereceye ayarlayın.
Reaktifleri steril bir 0,6 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne ekleyin. Toplam hacmin 25 mikrolitre olduğundan emin olun. Karıştırmak için çözeltiyi yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin ve bir saat boyunca ışıktan korunan 37 santigrat derece ısı bloğuna yerleştirin.
Bundan sonra, tüpü ısı bloğundan çıkarın ve 0.84 mikrolitre 100 mikromolar Phalloidin'i nazikçe karıştırmak için bir mikro pipet kullanın. Işıktan korunan oda sıcaklığında beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. Konfokukal görüntüleme için aktif kompozitler hazırlamak için, reaktifleri çözeltiye ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın.
Çözeltiyi üç adet 10 mikrolitrelik alikotlara bölün ve bunları K, K artı M ve negatif kontrol olarak etiketleyin. K artı M alikotuna 2.54 mikrolitre miyozin ve K'ya 2.54 mikrolitre PEM ve negatif kontrol alikotları ekleyin. Daha sonra karıştırmak için K ve K'ya 2,5 mikrolitre Kinesin kümeleri artı M alikotları ve pipetleri yukarı ve aşağı ekleyin.
Daha sonra, aynı tekniği kullanarak negatif kontrole 2,5 mikrolitre PEM ekleyin. Her bir çözeltiyi kılcal damar hareketi yoluyla numune odalarının ilgili kanalına yavaşça akıtmak için bir mikropipet kullanın. Kanala hava kabarcıkları sokmamak için pipet üzerinde çok yavaş ve nazikçe bastırın.
Her kanalın iki açık ucunu hızlı kuruyan epoksi veya UV kürlenebilir yapıştırıcı ile kapatın. Yapıştırıcı tamamen kuruduğunda, kompoziti ilk inaktif duruma mümkün olduğunca yakın görüntülemek için kanalı mikroskop üzerine yerleştirin. Önce K kanalını ve K artı M kanallarını ve ardından kontrol kanalını görüntüleyin.
Kinesin kümelerinin K ve K artı M aliquot'lara eklenmesi ile veri toplamanın başlangıcı arasında geçen süreye dikkat edin. Aktin'i aktin veya AA çapraz bağlayıcılara hazırlamak için, bir mikro santrifüj tüpüne Biotin-Aktin, NeutrAvidin, Biotin ve PEM ekleyin ve bunları yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Benzer şekilde, mikrotübüllerden mikrotübüllere veya MM çapraz bağlayıcılara mikrotübüller için, bir mikro santrifüj tüpüne Biotin-tübülin, NeutrAvidin, Biotin ve PEM ekleyin ve bunları yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın.
Su geçirmez bir sızdırmazlık oluşturmak için tüpü termoplastik bir tavan filmine sarın ve 90 dakika boyunca dört santigrat dereceye ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir sonikatör banyosunda yüzdürme salına yerleştirin. A-A çapraz bağlayıcı komplekslerini görüntüleme numunelerine dahil etmek için, reaktifleri bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin. Toplam hacmin 25 mikrolitre olduğundan emin olun.
Benzer şekilde, M-M çapraz bağlayıcı kompleksleri için, ekranda gösterilen reaktifleri bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın ve bir saat boyunca ışıktan korunan 37 santigrat derece ısı bloğuna yerleştirin. Bundan sonra, tüpü ısı bloğundan çıkarın ve 0.84 mikrolitre 100 mikromolar Phalloidin'i karıştırmak için bir mikro pipet kullanın.
Işıktan korunan oda sıcaklığında beş ila 10 dakika boyunca inkübe edin ve konfokal görüntüleme için aktif kompozitler hazırlamak için daha önce gösterilen prosedürü tekrarlayın. Aktin monofiberleri ve tübülin dimerleri, aktin filamentlerinin ve mikrotübüllerinin birbirine karışmış ağlarını oluşturmak için birlikte polimerize edilir. Myosin iki mini filament ve Kinesin kümeleri, kompozitleri kararlı durumdan çıkarmak için filamentleri iter ve çeker.
Pasif çapraz bağlama, biyotinile aktin filamentlerini veya mikrotübüllerini bağlamak için NeutrAvidin kullanılarak elde edilir. Myosin iki mini filament, Kinesin kümeleri veya her iki motor da pasif çapraz bağlantılar, aktin-aktin çapraz bağları ve mikrotübül-mikrotübül çapraz bağlantıları olmayan kompozitlere dahil edilir. Burada değişen miyozin konsantrasyonlarına ve molar aktin fraksiyonlarına sahip miyozin tahrikli sitoiskelet kompozitlerinin iki renkli konfokal görüntülemesi gösterilmiştir.
Partikül görüntü velosimetrisi, aktin miyozin aktivitesinin, birlikte dolaşık kompozitlerde aktin ve mikrotübüllerin koordineli kontraktil dinamiklerini tetiklediğini göstermektedir. Burada, farklı ok renkleri, vektör alanlarının sağındaki renk ölçeğinde belirtildiği gibi farklı hızlara karşılık gelir. Zaman çözümlü diferansiyel dinamik mikroskopi, hem aktin hem de mikrotübüller için dalga sayısına karşı bozunma sürelerinin özelliklerini belirlemek için zaman serilerinin mikrotübül ve aktin kanalları üzerinde gerçekleştirilir.
Büzülme hızları, her 45 dakikalık zaman serisinin tüm süresi boyunca tüm gecikme sürelerinin ortalaması alınan bozulma süresi eğrilerine uyumlar aracılığıyla belirlenir. Zaman çözümlü diferansiyel dinamik mikroskopi, aktin ve mikrotübüller için 45 dakikalık aktivasyon süresi boyunca ardışık altı dakikalık aralıklar için bozunma sürelerini değerlendirerek dinamiklerin zaman içinde nasıl değiştiğini ölçer. Aktin filamentleri ve mikrotübülleri için zaman çözümlü büzülme hızları, uyumlardan karşılık gelen bozunma zaman eğrilerine kadar belirlenir.
Uzamsal görüntü otomatik korelasyon analizi, deneyin başlangıcındaki farklı ağlar için otomatik korelasyon eğrilerini sonuna kıyasla karşılaştırarak aktif sitoiskelet bileşenlerinin motor tahrikli yeniden yapılandırılmasını ölçer. Otomatik korelasyon eğrilerinin üstel uyumları ile belirlenen zaman çözümlü korelasyon uzunlukları, büyük ölçüde yeniden yapılandırılanlara kıyasla yeniden yapılandırılmayan kompozitleri gösterir. Kinesin tahrikli aktin mikrotübül kompozitlerinin iki renkli konfokal görüntüsü, çapraz bağlayıcı kompozitlerin gevşek bir şekilde bağlanmış mikrotübül bakımından zengin kümelere yeniden yapılandırılması olmadan zaman içinde formülasyona bağlı yeniden yapılanmayı göstermektedir.
Aktin-aktin çapraz bağlama, aktin mikrotübül ko-lokalizasyonunu desteklerken, mikrotübül-mikrotübül çapraz bağlama D karıştırmayı geliştirir. Diferansiyel dinamik mikroskopi ve uzamsal görüntü otomatik korelasyon analizi, çapraz bağlama ve rakip misin ve Kinesin motorlarının kompozitlerin zaman içinde değişen dinamikleri ve yapısı üzerindeki etkisini göstermektedir. Hücresel koşulları daha yakından taklit etmek için, araştırmacılar ara filamentleri, diğer motorları ve filament uzunluklarını ve sertliklerini kontrol eden bağlayıcı proteinleri dahil edebilirler.
Kompozit mekaniği karakterize etmek için optik cımbız metrolojisi ölçümleri de yapılabilir. Yaklaşımımızı kullanarak, araştırmacılar, çeşitli hücresel süreçleri taklit etmek ve yeniden yapılandırılabilir programlanabilir malzemeler tasarlamak için benzeri görülmemiş bir faz alanı boyunca sitoiskeletten ilham alan kompozit aktif maddenin dinamiklerini ve yapısını hassas bir şekilde ayarlayabilirler.
