私たちの研究は、キネシンとミオシンモーターによって駆動され、積極的に調整、再構築、および移動するためにアクチンと微小管の複合材料を設計することにより、細胞骨格再構成の取り組みを細胞の状態を模倣することに重要な一歩を踏み出します。当社の複合材料のダイナミクスと構造は、さまざまなコンポーネントを個別に追加、除去、調整して、収縮、感染、脱落、粗大化、破裂の豊富な相ベースを示すことで正確にプログラムできます。私たちのアプローチは、単一のシステムに異なる基質に作用する複数の力発生コンポーネントを組み込んだ活性物質プラットフォームの設計、作成、および特性評価に広く適用できます。
手順を実演するのは、デイジー・アチリロアイエとマヤ・ヘンディヤです。当研究室の学部生研究員。まず、マイクロピペットと滅菌ピペットチップを使用して、滅菌黒色の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに試薬を追加し、微小管のペア間で結合して力を加えるキネシンモータークラスターを形成します。
溶液を上下にピペッティングして穏やかに混合します。次に、溶液を摂氏4度で30分間インキュベートし、光から保護します。アクトンフィラメントと微小管の共絡複合ネットワークを準備するには、ヒートブロックを摂氏37度に設定します。
試薬を滅菌済みの0.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブに追加します。総容量が25マイクロリットルであることを確認してください。溶液をゆっくりと上下にピペットで動かして混合し、光から保護された摂氏37度のヒートブロックに1時間置きます。
その後、チューブをヒートブロックから取り外し、マイクロピペットを使用して0.84マイクロリットルの100マイクロモルのファロイジンを穏やかに混合します。光から保護された室温で5〜10分間インキュベートします。焦点イメージング用の活性複合材料を調製するには、試薬を溶液に加え、上下にピペッティングして穏やかに混合します。
溶液を3つの10マイクロリットルアリコートに分割し、それらをK、KプラスM、およびネガティブコントロールとしてラベル付けします。2.54マイクロリットルのミオシンをKとMアリコートに加え、2.54マイクロリットルのPEMをKと陰性対照アリコートに加えます。次に、2.5マイクロリットルのキネシンクラスターをKとKに加えてMアリコートに加え、ピペットで上下に混ぜます。
次に、同じ手法を使用して2.5マイクロリットルのPEMをネガティブコントロールに追加します。マイクロピペットを使用して、毛細管現象を介して各溶液をサンプルチャンバーの対応するチャネルにゆっくりと流します。ピペットを非常にゆっくりと穏やかに押し下げて、気泡がチャネルに導入されないようにします。
各チャンネルの2つの開放端を速乾性エポキシまたはUV硬化型接着剤でシールします。接着剤が完全に乾いたら、チャンネルを顕微鏡上に置き、コンポジットをできるだけ初期の不活性状態に近づけて画像化します。最初にKチャンネルとKプラスMチャンネルをイメージし、次にコントロールチャンネルをイメージします。
KおよびKプラスMアリコートにキネシンクラスターを追加してからデータ取得を開始するまでの経過時間に注意してください。アクチンからアクチンまたはAA架橋剤を調製するには、ビオチン-アクチン、ニュートラアビジン、ビオチン、およびPEMをマイクロ遠心チューブに加え、上下にピペッティングして穏やかに混合します。同様に、微小管から微小管またはMM架橋剤の場合は、ビオチンチューブリン、ニュートラアビジン、ビオチン、およびPEMをマイクロ遠心チューブに加え、上下にピペッティングして穏やかに混合します。
チューブを熱可塑性天井フィルムで包み、防水シールを作成し、摂氏4度に設定した温度制御されたソニケーターバスの浮遊いかだに90分間入れます。A-A架橋剤複合体をイメージング用のサンプルに組み込むには、試薬をマイクロ遠心チューブに追加します。総容量が25マイクロリットルであることを確認してください。
同様に、M-M架橋剤複合体の場合は、スクリーンに示されている試薬をマイクロ遠心チューブに追加します。溶液を上下にピペッティングして混合し、光から保護された摂氏37度のヒートブロックに1時間置きます。その後、チューブをヒートブロックから取り外し、マイクロピペットを使用して0.84マイクロリットルの100マイクロモルのファロイジンを混合します。
光から保護された室温で5〜10分間インキュベートし、前に示した手順を繰り返して、共焦点イメージング用のアクティブコンポジットを準備します。アクチンモノファイバーとチューブリン二量体は共重合して、アクチンフィラメントと微小管の共絡絡ネットワークを形成します。ミオシン2本のミニフィラメントとキネシンクラスターがフィラメントを押したり引いたりして、複合材料を定常状態から追い出します。
受動架橋は、ビオチン化アクチンフィラメントまたは微小管を結合するためにNeutrAvidinを使用して達成されます。ミオシン2本のミニフィラメント、キネシンクラスター、または両方のモーターは、パッシブ架橋、アクチン-アクチン架橋および微小管-微小管架橋のない複合材料に組み込まれます。ここでは、ミオシン濃度とモルアクチン画分を変化させたミオシン駆動細胞骨格複合材料の2つのカラー共焦点イメージングを示します。
粒子画像速度測定は、アクチンミオシン活性が、共絡絡複合材料中のアクチンと微小管の協調収縮ダイナミクスを引き起こすことを示しています。ここでは、異なる矢印の色は、ベクトルフィールドの右側のカラースケールに示されているように、異なる速度に対応します。時間分解微分動的顕微鏡は、アクチンと微小管の両方の崩壊時間と波数の特性を決定するために、時系列の微小管チャネルとアクチンチャネルに対して実行されます。
収縮速度は、減衰時間曲線への適合によって決定され、各45分の時系列の全期間にわたってすべてのラグタイムにわたって平均化されます。時間分解微分動的顕微鏡は、アクチンと微小管の45分の活性化時間中の連続した6分間隔の減衰時間を評価することにより、ダイナミクスが時間とともにどのように変化するかを定量化します。アクチンフィラメントおよび微小管の時間分解収縮速度は、対応する減衰時間曲線への適合から決定されます。
空間画像自己相関分析は、実験開始時の異なるネットワークの自己相関曲線を実験終了時と比較することにより、活性細胞骨格成分の運動駆動型再構築を定量化します。自己相関曲線の指数適合によって決定された時間分解相関長は、実質的に再構築されるコンポジットと比較して再構築されないコンポジットを示します。キネシン駆動アクチン微小管複合材料の2つのカラー共焦点画像は、架橋剤複合材料が緩く接続された微小管リッチクラスターに再構築することなく、時間の経過とともに製剤依存的な再構築を示しています。
アクチン-アクチン架橋はアクチン微小管共局在をサポートし、微小管-微小管架橋はD混合を促進します。示差動的顕微鏡と空間画像自己相関分析は、複合材料の時間変化するダイナミクスと構造に対する架橋および競合するマイシンモーターとキネシンモーターの影響を示しています。細胞の状態をより厳密に模倣するために、研究者は中間フィラメント、他のモーター、およびフィラメントの長さと剛性を制御する結合タンパク質を組み込むことができます。
光ピンセット計測測定は、複合力学を特徴付けるために実行することもできます。私たちのアプローチを使用すると、研究者は、細胞骨格に触発された複合材料のダイナミクスと構造を前例のない位相空間全体で正確に調整して、多様な細胞プロセスをエミュレートし、再構成可能なプログラム可能な材料を設計できます。
