Наша работа приближает усилия по восстановлению цитоскелетов к имитации клеточных условий путем разработки композитов актина и микротрубочек, приводимых в действие кинезиновыми и миозиновыми двигателями для активной настройки, реструктуризации и перемещения. Динамика и структура наших композитов могут быть точно запрограммированы путем независимого добавления, удаления и настройки различных компонентов, чтобы продемонстрировать богатую фазовую базу сжатия, инфекции, обезвреживания, огрубления и разрыва. Наш подход широко применим к проектированию, созданию и характеристике платформ активной материи, которые включают в себя несколько компонентов, генерирующих силу, которые действуют на разные подложки в одной системе.
Демонстрировать процедуру будут Дейзи Ачирилоайе и Майя Хендия. Студенты-исследователи из нашей лаборатории. Для начала добавьте реагенты в стерильную черную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, используя микропипетку и стерильные наконечники пипеток, чтобы сформировать моторные кластеры Кинезина, которые связывают и оказывают силы между парами микротрубочек.
Осторожно перемешайте, пипетируя раствор вверх и вниз. Затем высиживают раствор в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, защищают его от света. Чтобы подготовить запутанную композитную сеть актонных нитей и микротрубочек, установите тепловой блок на 37 градусов Цельсия.
Добавьте реагенты в стерильную микроцентрифужную трубку размером 0,6 миллилитра. Убедитесь, что общий объем составляет 25 микролитров. Аккуратно выложите раствор вверх и вниз, чтобы смешать его и поместить на тепловой блок с температурой 37 градусов Цельсия, защищенный от света, в течение одного часа.
После этого извлеките трубку из теплового блока и с помощью микропипетки аккуратно перемешайте в 0,84 микролитра 100 микромолярного фаллоидина. Инкубировать в течение пяти-10 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Чтобы подготовить активные композиты для конфокальной визуализации, добавьте реагенты в раствор и аккуратно перемешайте путем пипетирования вверх и вниз.
Разделите раствор на три 10-микролитровые аликвоты и обозначьте их как K, K плюс M и отрицательный контроль. Добавьте 2,54 микролитра миозина к аликвоте K плюс M и 2,54 микролитра PEM к K и отрицательным контрольным аликвотам. Затем добавьте 2,5 микролитра кластеров Кинезина к Аликвотам K и K плюс M и пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать.
Затем добавьте 2,5 микролитра PEM к отрицательному контролю, используя ту же технику. Используйте микропипетку для медленного потока каждого раствора в соответствующий канал камер образца посредством капиллярного действия. Надавите вниз очень медленно и осторожно на пипетку, чтобы не вводить пузырьки воздуха в канал.
Запечатайте два открытых конца каждого канала быстросохнущим эпоксидным или УФ-отверждаемым клеем. Когда клей полностью высохнет, поместите канал на микроскоп, чтобы визуализировать композит как можно ближе к исходному неактивному состоянию. Сначала изобразите канал K и каналы K plus M, а затем канал управления.
Обратите внимание на время, прошедшее между добавлением кластеров Kinesin к аликвотам K и K плюс M и началом сбора данных. Чтобы приготовить актин к актину или сшивателям АА, добавьте биотин-актин, нейтравидин, биотин и ПЭМ в микроцентрифужную трубку и аккуратно перемешайте их путем пипетирования вверх и вниз. Аналогичным образом, для микротрубочек к микротрубочкам или сшивателям ММ добавьте биотин-тубулин, нейтравидин, биотин и ПЭМ в микроцентрифужную трубку и аккуратно перемешайте их путем пипетки вверх и вниз.
Оберните трубку в термопластичную потолочную пленку, чтобы создать водонепроницаемое уплотнение, и поместите их во флотационный плот в ванне с контролируемой температурой, установленной на четыре градуса Цельсия в течение 90 минут. Чтобы включить сшивающие комплексы A-A в образцы для визуализации, добавьте реагенты в микроцентрифужную трубку. Убедитесь, что общий объем составляет 25 микролитров.
Аналогичным образом, для сшивающих комплексов M-M добавьте реагенты, показанные на экране, в микроцентрифужную трубку. Смешайте раствор путем пипетки вверх и вниз и поместите его на тепловой блок с температурой 37 градусов Цельсия, защищенный от света, в течение одного часа. После этого извлеките трубку из теплового блока и с помощью микропипетки смешайте в 0,84 микролитра 100 микромолярного фаллоидина.
Инкубируйте в течение пяти-10 минут при комнатной температуре, защищенной от света, и повторите процедуру, показанную ранее, чтобы подготовить активные композиты для конфокальной визуализации. Моноволокна актина и димеры тубулина сополимеризуются с образованием запутанных сетей актиновых нитей и микротрубочек. Миозин две мини-нити и кластеры Кинезина толкают и тянут на нити, чтобы вывести композиты из устойчивого состояния.
Пассивное сшивание достигается с помощью NeutrAvidin для связывания биотинилированных актиновых нитей или микротрубочек. Миозин две мини-нити, кинезиновые кластеры или оба двигателя включены в композиты без пассивных сшивок, актин-актиновые сшивки и микротрубочки-микротрубочки сшивки. Здесь показана двухцветная конфокальная визуализация цитоскелетных композитов, управляемых миозином, с различными концентрациями миозина и молярными фракциями актина.
Велоциметрия изображений частиц показывает, что активность актина миозина вызывает скоординированную сократительную динамику актина и микротрубочек в запутанных композитах. Здесь разные цвета стрелок соответствуют разным скоростям, как указано в цветовой шкале справа от векторных полей. Дифференциальная динамическая микроскопия с временным разрешением выполняется на микротрубочках и актиновых каналах временных рядов для определения характеристик времени распада по сравнению с волновым числом как для актина, так и для микротрубочек.
Скорости сжатия определяются с помощью кривых времени прилегания к затуханию, усредненных по всем временам задержки за всю продолжительность каждого 45-минутного временного ряда. Дифференциальная динамическая микроскопия с временным разрешением количественно определяет, как динамика изменяется с течением времени, оценивая время распада для последовательных шестиминутных интервалов в течение 45-минутного времени активации для актина и микротрубочек. Разрешенные по времени скорости сжатия для актиновых нитей и микротрубочек определяются от припадков к соответствующим кривым времени распада.
Автоматический корреляционный анализ пространственных изображений количественно определяет моторную реструктуризацию активных компонентов цитоскелета путем сравнения кривых автоматической корреляции для различных сетей в начале эксперимента по сравнению с концом. Разрешенные по времени длины корреляции, определяемые с помощью экспоненциальных припадков кривых автоматической корреляции, показывают композиты, которые не реструктурируются по сравнению с теми, которые существенно реструктурируются. Два цветных конфокальных изображения композитов актиновых микротрубочек, управляемых кинезином, показывают зависимую от формулы реструктуризацию с течением времени без реструктуризации сшивающих композитов в слабо связанные кластеры, богатые микротрубочками.
Поперечное связывание актин-актин поддерживает совместную локализацию актиновых микротрубочек, в то время как сшивание микротрубочек-микротрубочек усиливает смешивание D. Дифференциальная динамическая микроскопия и автоматический корреляционный анализ пространственных изображений показывают влияние сшивки и конкурирующих двигателей микина и кинезина на изменяющуюся во времени динамику и структуру композитов. Чтобы более точно имитировать клеточные условия, исследователи могут включать промежуточные нити, другие двигатели и связывающие белки, которые контролируют длину и жесткость нитей.
Метрологические измерения оптического пинцета также могут быть выполнены для характеристики композитной механики. Используя наш подход, исследователи могут точно настроить динамику и структуру композитного активного вещества, вдохновленного цитоскелетом, в беспрецедентном фазовом пространстве для эмуляции различных клеточных процессов и разработки реконфигурируемых программируемых материалов.
