由于嵌入的蛋白质和糖的存在，细胞膜高度拥挤。我们在合成拥挤的脂质双层上演示了单分子成像。该平台可用于在分子水平上研究拥挤对膜生物分子反应的影响。
该协议解释了膜生物分子的结合，扩散和组装的分析。实验的成功取决于对底物的严格清洁，避免损坏双层，并在单分子成像中保持高信噪比。和我一起演示该程序的是Aditya Upasani和Vishwesh Haricharan Rai，他们是实验室的研究生。
首先将等离子处理过的丙烯酸载玻片放在干净的薄纸上。剥开双面激光切割胶带并将其粘贴到载玻片上。使用移液器吸头将胶带压平，以防止从一个通道泄漏到另一个通道。
通过将等离子处理的盖玻片放在胶带载玻片上来关闭腔室。使用移液器吸头，轻轻按压胶带区域上的盖玻片，使通道防水。如果使用载玻片，请使用环氧树脂密封边缘。
将准备好的微流体成像室在干燥条件下储存一到两周。取使用食人鱼溶液预先清洁的玻璃小瓶，加入缓冲液后，以所需的PEG 2000脂质摩尔分数加入POPC和DOPE-PEG（2000）的氯仿溶液，以获得3毫摩尔的最终脂质浓度。类似地，可以制备脂质的其它膜组合物。
接下来，使用带有小漩涡的温和氮气流从小瓶中干燥氯仿，以便将所需的脂质均匀地涂覆在小瓶表面上。通过将小瓶在真空干燥器中保持一小时来去除残留的氯仿。然后将一毫升PBS加入小瓶中，并在37摄氏度下孵育过夜。
孵育过夜后，轻轻涡旋小瓶一到两分钟，直到溶液变浑浊和乳白色。现在将100微升该溶液转移到一个小的500微升离心管中。为了产生直径为50至100纳米的小单层囊泡，请将溶液在浴超声仪中超声处理约一小时。
在超声处理结束时，溶液将变得澄清，如果溶液仍然浑浊，则再超声处理30分钟。然后将氯化钙添加到超声囊泡中，至脂质溶液中的终浓度为30毫摩尔。切开微量移液器吸头以注入样品溶液，使其紧密地贴合孔中。
混合脂质溶液并通过成像室中的一个孔注入。用干净的纸巾擦拭从出口流出的多余溶液，以防止污染相邻通道。通过将湿纸巾放在50毫升离心管的末端来准备加湿室。
将载玻片放入管中并关闭管盖。将管侧放，并将该组件放在加湿室中90分钟，最好在37摄氏度的培养箱中。用大量的PBS缓冲液彻底清洗腔室，防止气泡在清洗时进入腔室，因为这会在膜上产生缺陷。
在进行任何迁移率和组装实验之前，通过制备荧光珠样品并将其以低浓度添加到微流体通道中来对准TIRF显微镜，以使单个磁珠的荧光斑点不会在图像中重叠。首先，在落射荧光模式下可视化磁珠。当照明处于落射荧光模式时，移动位于平移载物台上的M5反射镜，使从物镜出来的光束弯曲，直到达到全内反射配置。
要验证是否已实现 TIR 照明，请检查当 TIR 倏逝场照亮磁珠样品时，是否仅看到表面上的磁珠，并且未观察到远离表面的自由漂浮磁珠。在实验开始时，将物镜后焦平面的激光功率设置为5至10毫瓦，以防止荧光团的光破坏。将载玻片放在显微镜载物台上并首先聚焦在裸膜上，脂质膜中的微量杂质足以使膜可视化。
使用微量移液管将样品注入PEG SLB涂层成像室。为了测量单分子结合动力学，使用注射泵以每分钟50至500微升的流速将标记的生物分子通过入口孔流入微流体室。要以每秒25至50帧的速度记录5， 000帧，请设定所需的短片采集参数。
开始电影采集并在注射泵的连续流动下采集超过5， 000帧，直到膜表面上新斑点的出现不再增加，并分析手稿中所述的结合动力学。对于单颗粒跟踪，使用微量移液器将低浓度的标记生物分子添加到通道中。为了确保从数据集中恢复的轨迹的高保真度，请将浓度优化为每平方微米小于0.1个颗粒的密度，以便单个颗粒很少交叉路径。
如果需要，在加湿环境中孵育室，并在成像前用缓冲液洗涤。对于单粒子轨迹分析，以每秒10至100帧的速度采集200至500帧，并在图像采集过程中保持物镜聚焦在双层平面上，载物镜漂移最小。为了测量亚基，将相关浓度的标记生物分子添加到微流体成像室中，并将载玻片在所需温度的加湿室中孵育所需时间。
成像前，用缓冲液清洗成像室。将载玻片放在显微镜上并调整焦点以可视化标记的分子。将激光功率设置为荧光团逐渐漂白的水平。
理想情况下，对于每个组装的复合物，控制激光功率，以保持照片漂白步率在10到20帧之间，如手稿中所述，并获取图像，直到所有分子完全光漂白。通过在将样品引入腔室后立即开始电影采集，并在从PEG SLB的不同片段结合膜后以固定的时间间隔获取新的光漂白膜，从而执行时间依赖性的组装测量。溶瘤素A与脂质膜结合，5摩尔百分比的DOPE-PEG（2000）显示出增加的颗粒密度并达到饱和度。
拟合结合颗粒的指数衰变函数给出了溶细胞素A膜结合的时间常数。膜中没有任何PEG聚合物，大多数示踪剂在SLB上的扩散受到限制。 膜双层中的小水平PEG 2000从下层表面抬起，允许示踪分子在没有表面约束的情况下扩散。
然而，在双层膜中高浓度的PEG下观察到极端限制。亲脂性DNA示踪剂在两种不同的PEG 2000脂质膜中扩散的ISD2分布在高浓度PEG下显示出迁移率降低。在拥挤的脂质双层膜上孵育后，溶细胞素A显示出许多不同的光漂白步骤，表明形成了各种组装中间体。
校正标记效率后，低聚物的最终分布显示十二碳酸溶细胞素A物种为主导结构。膜蛋白结合组装和其他反应应在适当的膜拥挤环境中进行。应注意清洁成像室，避免破坏双层，并设置TIRF显微镜。
