細胞膜は、埋め込まれたタンパク質と糖の存在のために非常に混雑しています。合成の混雑した支持脂質二重層での単一分子イメージングを実証します。このプラットフォームは、膜生体分子反応に対するクラウディングの影響を分子レベルで調べるのに有用です。
このプロトコルは、膜生体分子の結合、拡散、およびアセンブリの分析を説明しています。実験の成功は、基板の厳密な洗浄、二重層への損傷の回避、および単一分子イメージングにおける高いS/N比の維持にかかっています。私と一緒に手順を実演するのは、研究室の大学院生であるアディティア・ウパサニとヴィシュウェシュ・ハリチャラン・ライです。
プラズマ処理されたアクリルスライドをきれいなティッシュペーパーの上に置くことから始めます。両面レーザーカットテープをはがし、スライドに貼り付けます。ピペットチップを使用してテープを平らにし、一方のチャンネルからもう一方のチャンネルへの漏れを防ぎます。
プラズマ処理されたカバースリップをテープスライドの上に置いてチャンバーを閉じます。ピペットチップを使用して、テープで留められた領域のカバースリップをそっと押して、チャネルを水密にします。スライドガラスを使用する場合は、エポキシ樹脂を使用して端をシールします。
調製したマイクロ流体イメージングチャンバーを乾燥条件下で1〜2週間保管します。ピラニア溶液を使用して事前に洗浄したガラスバイアルを取り、バッファーを加えた後、PEG 2000脂質の所望のモル分率でPOPCおよびDOPE-PEG(2000)のクロロホルム溶液を加えて、3ミリモルの最終脂質濃度を得る。同様に脂質の他の膜組成物を調製することができる。
次に、所望の脂質がバイアルの表面に均一にコーティングされるように、小さな渦巻きを伴う穏やかな窒素流を使用してバイアルからクロロホルムを乾燥させる。バイアルを真空デシケーターに1時間保持して、残留クロロホルムを除去します。次に、1ミリリットルのPBSをバイアルに加え、摂氏37度で一晩インキュベートします。
一晩インキュベーションした後、溶液が濁って乳白色になるまで、バイアルを1〜2分間静かにボルテックスします。次に、この溶液100マイクロリットルを小さな500マイクロリットルの遠沈管に移します。直径50〜100ナノメートルの小さな単層小胞を生成するには、浴超音波処理器で約1時間溶液を超音波処理する。
超音波処理の終わりに、溶液がまだ濁っている場合は、溶液が透明になり、さらに30分間超音波処理します。次に、脂質溶液中の30ミリモルの最終濃度に超音波処理された小胞に塩化カルシウムを加える。マイクロピペットチップをカットしてサンプル溶液を注入し、穴にしっかりと収まるようにします。
脂質溶液を混合し、イメージングチャンバーの穴の1つから注入します。隣接するチャネルの汚染を防ぐために、出口からチャンバーから出てくる余分な溶液をきれいなティッシュで拭きます。50ミリリットルの遠沈管の端にウェットティッシュを置いて加湿室を準備します。
スライドをチューブに入れ、チューブキャップを閉じます。チューブを横向きに置き、このアセンブリを加湿チャンバーに90分間、できれば摂氏37度のインキュベーターに入れます。大量のPBSバッファーでチャンバーを完全に洗浄し、膜に欠陥が発生する可能性があるため、洗浄中に気泡がチャンバーに入るのを防ぎます。
移動性と組み立てに関する実験を行う前に、蛍光ビーズサンプルを準備し、単一のビーズの蛍光スポットが画像内で重ならないように低濃度でマイクロ流体チャネルに追加することにより、TIRF顕微鏡の位置合わせをします。まず、落射蛍光モードでビーズを視覚化します。照明が落射蛍光モードのときに、平行移動ステージ上にあるM5ミラーを動かして、対物レンズから出てくるビームが全反射構成になるまで曲がるようにします。
TIR照明が達成されたかどうかを確認するには、TIRエバネッセントフィールドがビーズサンプルを照らしているときに表面のビーズのみが見え、表面から離れた自由に浮遊するビーズが観察されないことを確認します。実験の開始時に、対物レンズの後方焦点面のレーザー出力を5〜10ミリワットに設定して、蛍光色素の光破壊を防ぎます。スライドを顕微鏡ステージに保ち、最初に裸の膜に焦点を合わせると、脂質膜中の微量の不純物が膜を視覚化するのに十分です。
マイクロピペットを使用してサンプルをPEG SLBコーティングされたイメージングチャンバーに注入します。単一分子結合動態を測定するには、シリンジポンプを使用して、標識された生体分子を入口孔からマイクロ流体チャンバーに毎分50〜500マイクロリットルの流量で流します。毎秒25〜50フレームで5, 000フレームを記録するには、必要なムービー取得パラメータを設定します。
フィルム取得を開始し、膜表面に新しいスポットの出現がさらに増加しなくなるまで、シリンジポンプからの連続フロー下で5, 000フレーム以上を取得し、原稿に記載されているように結合速度論を分析します。単粒子追跡の場合は、マイクロピペットを使用して低濃度で標識した生体分子をチャネルに追加します。データセットから回収されたトラックの忠実度を高めるには、濃度を1平方マイクロメートルあたり0.1粒子未満の密度に最適化して、個々の粒子が経路を横切ることがめったにないようにします。
必要に応じて、チャンバーを加湿環境でインキュベートし、イメージング前にバッファーで洗浄します。単粒子軌道解析では、毎秒10〜100フレームで200〜500フレームを取得し、画像取得中のステージドリフトを最小限に抑えて、対物レンズを二層平面に焦点を合わせたままにします。サブユニットを測定するには、関連する濃度の標識生体分子をマイクロ流体イメージングチャンバーに追加し、スライドを加湿チャンバー内で希望の温度で必要な時間インキュベートします。
イメージングの前に、イメージングチャンバーをバッファーで洗浄してください。スライドを顕微鏡に置き、焦点を調整して標識された分子を視覚化します。レーザー出力を、蛍光色素の漂白が徐々に起こるレベルに設定します。
理想的には、組み立てられた複合体ごとにレーザー出力を制御して、原稿に記載されているように光退色ステップ速度を10〜20フレーム離して維持し、すべての分子が完全に光退色されるまで画像を取得します。サンプルがチャンバーに導入されたらすぐに動画取得を開始し、PEG SLBの異なるセグメントから膜結合後に一定の時間間隔で新しい光退色動画を取得することにより、時間依存アセンブリ測定を実行します。5モルパーセントのDOPE-PEG(2000)で脂質膜にサイトライシンAを結合すると、粒子密度が増加し、飽和が達成されました。
結合粒子に適合する指数関数減衰関数は、サイトライシンA膜結合の時定数を与えます。膜にPEGポリマーが含まれていない場合、ほとんどのトレーサーはSLB上での拡散が制限されていました。 膜二重層中の少量のPEG 2000が下の表面から持ち上げられ、トレーサー分子が表面の制約なしに拡散することを可能にしました。
しかしながら、二分子膜中の高濃度のPEGでは極端な閉じ込めが観察される。2つの異なるPEG 2000脂質膜における親油性DNAトレーサーの拡散のためのISD2分布は、高濃度のPEGで移動度の低下を示しました。混雑した脂質二重膜上でインキュベートした後、Cytolysin Aは多くの異なる光退色ステップを示し、様々な集合中間体の形成を示唆した。
標識効率を補正した後、オリゴマーの最終的な分布は、ドデカマーのサイトライシンA種を優勢な構造として示した。膜タンパク質結合アセンブリおよびその他の反応は、適切な膜混雑環境で実施する必要があります。イメージングチャンバーの洗浄、二重層の破壊の回避、およびTIRF顕微鏡のセットアップに注意を払う必要があります。
