Zellmembranen sind aufgrund des Vorhandenseins eingebetteter Proteine und Zucker stark überfüllt. Wir demonstrieren Einzelmolekül-Bildgebung an synthetischen überfüllten Lipiddoppelschichten. Diese Plattform ist nützlich, um die Auswirkungen von Crowding auf biomolekulare Reaktionen der Membran auf molekularer Ebene zu untersuchen.
Das Protokoll erklärt die Analyse der Bindung, Diffusion und Assemblierung von Membranbiomolekülen. Der Erfolg des Experiments hängt von der rigorosen Reinigung des Substrats, der Vermeidung von Schäden an der Doppelschicht und der Aufrechterhaltung eines hohen Signal-Rausch-Verhältnisses bei der Einzelmolekülbildgebung ab. Das Verfahren demonstrieren mir Aditya Upasani und Vishwesh Haricharan Rai, Doktoranden aus dem Labor.
Legen Sie zunächst den plasmabehandelten Acrylobjektträger auf sauberes Seidenpapier. Ziehen Sie das doppelseitige lasergeschnittene Klebeband ab und kleben Sie es auf den Objektträger. Flachen Sie das Band mit einer Pipettenspitze, um ein Auslaufen von einem Kanal zum anderen zu verhindern.
Schließen Sie die Kammer, indem Sie den plasmabehandelten Deckschlitz auf den geklebten Objektträger legen. Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die abgeklebten Bereiche, um den Kanal wasserdicht zu machen. Bei Verwendung von Glasobjektträgern die Kanten mit Epoxidharz abdichten.
Lagern Sie die vorbereiteten mikrofluidischen Bildgebungskammern für ein bis zwei Wochen unter getrockneten Bedingungen. Man nimmt eine Glasdurchstechflasche, die mit Piranha-Lösung vorgereinigt wurde, und fügt Chloroformlösung aus POPC und DOPE-PEG (2000) in der gewünschten Molfraktion von PEG 2000-Lipiden hinzu, um nach Zugabe des Puffers die endgültige Lipidkonzentration von drei Millimol zu erhalten. Ebenso können andere Membranzusammensetzungen von Lipiden hergestellt werden.
Als nächstes trocknen Sie das Chloroform aus der Durchstechflasche mit einem sanften Stickstoffstrom mit einem kleinen Wirbel, so dass die gewünschten Lipide gleichmäßig auf der Oberfläche der Durchstechflasche beschichtet sind. Entfernen Sie Restchloroform, indem Sie die Durchstechflasche eine Stunde lang in einem Vakuum-Exsikkator aufbewahren. Dann einen Milliliter PBS in die Durchstechflasche geben und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nach der Inkubation über Nacht die Durchstechflasche ein bis zwei Minuten lang vorsichtig vorziehen, bis die Lösung trüb und milchig wird. Nun werden 100 Mikroliter dieser Lösung in ein kleines 500 Mikroliter Zentrifugenröhrchen überführt. Um kleine unilamellare Vesikel von 50 bis 100 Nanometern Durchmesser zu erzeugen, wird die Lösung etwa eine Stunde lang in einem Badesonikator beschallt.
Am Ende der Beschallung wird die Lösung klar, wenn die Lösung noch trüb ist, dann für weitere 30 Minuten beschallen. Dann fügen Sie den beschallten Vesikeln Calciumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 30 Millimolar in der Lipidlösung hinzu. Schneiden Sie eine Mikropipettenspitze ab, um die Probenlösung so zu injizieren, dass sie fest in das Loch passt.
Mischen Sie die Lipidlösung und injizieren Sie sie durch eines der Löcher in der Bildgebungskammer. Wischen Sie die überschüssige Lösung, die aus der Kammer kommt, mit sauberem Tuch ab, um die Kontamination benachbarter Kanäle zu verhindern. Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer vor, indem Sie nasses Tuch am Ende eines 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchens platzieren.
Legen Sie den Schieber in die Röhre und schließen Sie die Schlauchkappe. Legen Sie das Rohr seitlich und lassen Sie diese Baugruppe 90 Minuten in einer befeuchteten Kammer, vorzugsweise in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Kammer gründlich mit einer großen Menge PBS-Puffer, um zu verhindern, dass während des Waschens Luftblasen in die Kammer gelangen, da dies zu Defekten in der Membran führen kann.
Bevor Sie ein Experiment zur Mobilität und Montage durchführen, richten Sie das TIRF-Mikroskop aus, indem Sie eine fluoreszierende Perlenprobe vorbereiten und sie in niedrigen Konzentrationen in den mikrofluidischen Kanal geben, so dass sich fluoreszierende Flecken von einzelnen Perlen in den Bildern nicht überlappen. Visualisieren Sie zunächst die Perlen im Epifluoreszenzmodus. Während sich die Beleuchtung im Epifluoreszenzmodus befindet, bewegen Sie den M5-Spiegel auf einem Translationstisch sitzend, so dass sich der aus dem Objektiv kommende Strahl biegt, bis eine vollständige interne Reflexionskonfiguration erreicht ist.
Um zu überprüfen, ob die TIR-Beleuchtung erreicht wurde, ist zu überprüfen, ob nur die Perlen auf der Oberfläche sichtbar sind, wenn das TIR-Evaneszenzfeld die Perlenprobe beleuchtet und keine frei schwebenden Perlen von der Oberfläche entfernt beobachtet werden. Stellen Sie zu Beginn des Experiments die Laserleistung an der hinteren Brennebene des Objektivs auf fünf bis 10 Milliwatt ein, um eine Photozerstörung der Fluorophore zu verhindern. Halten Sie den Objektträger auf dem Mikroskoptisch und konzentrieren Sie sich zuerst auf die nackte Membran, kleine Spuren von Verunreinigungen in Lipidmembranen reichen aus, um die Membran sichtbar zu machen.
Injizieren Sie die Probe mit einer Mikropipette in die PEG SLB-beschichtete Bildgebungskammer. Zur Messung der Einzelmolekülbindungskinetik werden die markierten Biomoleküle mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 50 bis 500 Mikrolitern pro Minute durch die Einlasslöcher in die mikrofluidische Kammer geleitet. Um 5.000 Bilder mit 25 bis 50 Bildern pro Sekunde aufzunehmen, legen Sie die erforderlichen Filmaufnahmeparameter fest.
Starten Sie die Filmaufnahme und erfassen Sie mehr als 5.000 Bilder unter kontinuierlichem Durchfluss von der Spritzenpumpe, bis das Auftreten neuer Flecken auf der Membranoberfläche nicht weiter zunimmt, und analysieren Sie die Bindungskinetik, wie im Manuskript beschrieben. Für die Einzelpartikelverfolgung fügen Sie die markierten Biomoleküle in geringen Konzentrationen mit einer Mikropipette in den Kanal ein. Um die hohe Genauigkeit der aus den Datensätzen gewonnenen Spuren zu gewährleisten, optimieren Sie die Konzentration auf eine Dichte von weniger als 0,1 Partikeln pro Quadratmikrometer, so dass sich einzelne Partikel selten kreuzen.
Falls erforderlich, inkubieren Sie die Kammer in einer befeuchtenden Umgebung und waschen Sie sie vor der Bildgebung mit dem Puffer. Für die Analyse der Flugbahn einzelner Partikel erfassen Sie 200 bis 500 Bilder bei 10 bis 100 Bildern pro Sekunde und halten Sie das Objektiv während der Bildaufnahme mit minimaler Stufendrift auf die Doppelschichtebene fokussiert. Für die Messung von Untereinheiten fügen Sie die entsprechende Konzentration der markierten Biomoleküle in die mikrofluidische Bildgebungskammer hinzu und inkubieren den Objektträger in einer Befeuchtungskammer bei der gewünschten Temperatur für die erforderliche Zeit.
Vor der Bildgebung waschen Sie die Bildgebungskammer mit einem Puffer. Legen Sie den Objektträger auf ein Mikroskop und passen Sie den Fokus an, um die markierten Moleküle sichtbar zu machen. Stellen Sie die Laserleistung auf ein Niveau ein, bei dem das Bleichen des Fluorophors allmählich erfolgt.
Ideal für jede zusammengesetzte komplexe Steuerung der Laserleistung, um die Photobleichschrittrate zwischen 10 und 20 Bildern auseinander zu halten, wie im Manuskript beschrieben, und die Bilder zu erfassen, bis alle Moleküle vollständig photogebleicht sind. Führen Sie eine zeitabhängige Montagemessung durch, indem Sie die Filmaufnahme starten, sobald die Probe in die Kammer eingeführt wird, und neue Fotobleichfilme in festen Zeitintervallen nach der Membranbindung aus verschiedenen Segmenten des PEG SLB aufnehmen. Die Bindung von Cytolysin A an Lipidmembranen mit fünf Molprozent DOPE-PEG(2000) zeigte eine erhöhte Partikeldichte und erreichte eine erreichte Sättigung.
Eine exponentielle Zerfallsfunktion, die an die gebundenen Partikel angepasst ist, ergibt die Zeitkonstante für die Cytolysin-A-Membranbindung. Ohne PEG-Polymer in der Membran zeigten die meisten Tracer eine eingeschränkte Diffusion auf SLBs. Kleine Mengen von PEG 2000 in der Membrandoppelschicht hoben sich von der darunter liegenden Oberfläche ab, so dass die Tracermoleküle ohne Oberflächenbeschränkungen diffundieren konnten.
Ein extremer Einschluss wird jedoch bei einer hohen Konzentration von PEG in der Doppelschichtmembran beobachtet. Die ISD2-Verteilung für die Diffusion lipophiler DNA-Tracer in zwei verschiedenen PEG 2000-Lipidmembranen zeigte eine verminderte Mobilität bei hohen PEG-Konzentrationen. Nach dem Inkubieren auf der überfüllten Lipiddoppelschichtmembran zeigte Cytolysin A viele verschiedene Photobleichschritte, was auf die Bildung verschiedener Montagezwischenprodukte hindeutet.
Nach Korrektur der Markierungseffizienz zeigte die endgültige Verteilung der Oligomere die dodekamere Cytolysin-A-Spezies als dominante Struktur. Die Membranproteinbindungsmontage und andere Reaktionen sollten in geeigneten Membran-Crowding-Umgebungen durchgeführt werden. Es sollte darauf geachtet werden, die Bildgebungskammer zu reinigen, eine Unterbrechung der Doppelschicht zu vermeiden und das TIRF-Mikroskop einzurichten.
