Les membranes cellulaires sont très encombrées en raison de la présence de protéines et de sucres intégrés. Nous démontrons l’imagerie d’une seule molécule sur des bicouches lipidiques synthétiques encombrées. Cette plateforme est utile pour étudier l’effet de l’encombrement sur les réactions biomoléculaires membranaires, au niveau moléculaire.
Le protocole explique l’analyse de la liaison, de la diffusion et de l’assemblage de biomolécules membranaires. Le succès de l’expérience dépend d’un nettoyage rigoureux du substrat, d’éviter d’endommager la bicouche et de maintenir un rapport signal sur bruit élevé en imagerie à molécule unique. Aditya Upasani et Vishwesh Haricharan Rai, étudiants diplômés du laboratoire, font la démonstration de la procédure avec moi.
Commencez par placer la lame acrylique traitée au plasma sur du papier de soie propre. Décollez le ruban laser double face et collez-le à la lame. À l’aide d’une pointe de pipette, aplatissez le ruban pour éviter les fuites d’un canal à l’autre.
Fermez la chambre en plaçant le couvercle traité au plasma sur la lame collée. À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez doucement sur le couvercle sur les zones collées pour rendre le canal étanche. Si vous utilisez des lames de verre, scellez les bords à l’aide de résine époxy.
Conservez les chambres d’imagerie microfluidique préparées pendant une à deux semaines dans des conditions desséchées. Prélever un flacon en verre prénettoyé à l’aide de la solution de Piranha et ajouter une solution de chloroforme de POPC et DOPE-PEG(2000) à la fraction molaire souhaitée de lipides PEG 2000 pour obtenir la concentration lipidique finale de trois millimolaires, après avoir ajouté le tampon. De même, d’autres compositions membranaires de lipides peuvent être préparées.
Ensuite, séchez le chloroforme du flacon à l’aide d’un léger jet d’azote avec un petit tourbillon afin que les lipides souhaités soient uniformément enrobés à la surface du flacon. Éliminer le chloroforme résiduel en conservant le flacon dans un dessiccateur sous vide pendant une heure. Ajoutez ensuite un millilitre de PBS au flacon et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Après une nuit d’incubation, vortex doucement le flacon pendant une à deux minutes jusqu’à ce que la solution devienne trouble et laiteuse. Maintenant, transférez 100 microlitres de cette solution dans un petit tube centrifuge de 500 microlitres. Pour générer de petites vésicules unilamellaires de 50 à 100 nanomètres de diamètre, sonicer la solution pendant environ une heure dans un sonicateur de bain.
À la fin de la sonication, la solution deviendra claire, si la solution est encore trouble, sonicer pendant 30 minutes supplémentaires. Ajoutez ensuite du chlorure de calcium aux vésicules soniquées jusqu’à une concentration finale de 30 millimolaires dans la solution lipidique. Coupez une pointe de micro-pipette pour injecter la solution d’échantillon afin qu’elle s’insère bien dans le trou.
Mélangez la solution lipidique et injectez-la par l’un des trous de la chambre d’imagerie. Essuyez l’excès de solution qui sort de la chambre de la sortie avec un tissu propre pour éviter la contamination des canaux adjacents. Préparez une chambre d’humidification en plaçant le tissu humide à l’extrémité d’un tube à centrifuger de 50 millilitres.
Placez la glissière dans le tube et fermez le capuchon du tube. Posez le tube sur le côté et laissez cet ensemble dans une chambre humidifiée pendant 90 minutes, de préférence dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Lavez soigneusement la chambre avec une grande quantité de tampon PBS, empêchant les bulles d’air de pénétrer dans la chambre pendant le lavage, car cela peut générer des défauts dans la membrane.
Avant de mener toute expérience sur la mobilité et l’assemblage, aligner le microscope TIRF en préparant un échantillon de billes fluorescentes et en les ajoutant dans le canal microfluidique à de faibles concentrations de sorte que les taches fluorescentes provenant de billes simples ne se chevauchent pas dans les images. Tout d’abord, visualisez les billes en mode épifluorescence. Lorsque l’éclairage est en mode épifluorescence, déplacer le miroir M5 assis sur une platine de translation de telle sorte que le faisceau sortant de l’objectif se plie jusqu’à ce que la configuration totale de la réflexion interne soit atteinte.
Pour vérifier si l’éclairage TIR a été obtenu, vérifier que seules les billes à la surface sont visibles lorsque le champ d’évanescence TIR éclaire l’échantillon de cordon et que les billes flottant librement loin de la surface ne sont pas observées. Au début de l’expérience, réglez la puissance laser sur le plan focal arrière de l’objectif sur cinq à 10 milliwatts pour empêcher la photodestruction des fluorophores. Gardez la lame sur la scène du microscope et concentrez-vous d’abord sur la membrane nue, de petites traces d’impuretés dans les membranes lipidiques sont suffisantes pour visualiser la membrane.
Injectez l’échantillon à l’aide d’une micropipette dans la chambre d’imagerie revêtue de PEG SLB. Pour mesurer la cinétique de liaison à une seule molécule, utilisez une pompe à seringue pour faire circuler les biomolécules marquées à travers les trous d’entrée dans la chambre microfluidique à un débit de 50 à 500 microlitres par minute. Pour enregistrer 5 000 images à 25 à 50 images par seconde, définissez les paramètres d’acquisition vidéo requis.
Commencez l’acquisition de films et acquérez plus de 5 000 images en flux continu à partir de la pompe à seringue jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’augmentation de l’apparition de nouvelles taches sur la surface de la membrane, et analysez la cinétique de liaison comme décrit dans le manuscrit. Pour le suivi des particules uniques, ajoutez les biomolécules marquées à de faibles concentrations dans le canal à l’aide d’une micropipette. Pour assurer la haute fidélité des traces récupérées à partir des ensembles de données, optimiser la concentration à une densité inférieure à 0,1 particule par micromètre carré, de sorte que les particules individuelles se croisent rarement.
Si nécessaire, incuber la chambre dans un environnement d’humidification et laver avec le tampon avant l’imagerie. Pour l’analyse de trajectoire de particules uniques, acquérir 200 à 500 images à 10 à 100 images par seconde et maintenir la lentille de l’objectif focalisée sur le plan bicouche avec une dérive minimale de l’étage pendant l’acquisition de l’image. Pour mesurer les sous-unités, ajoutez la concentration pertinente de biomolécules marquées à la chambre d’imagerie microfluidique et incuber la lame dans une chambre d’humidification à la température souhaitée pendant le temps requis.
Avant l’imagerie, lavez la chambre d’imagerie avec un tampon. Placez la lame sur un microscope et ajustez la mise au point pour visualiser les molécules marquées. Réglez la puissance laser à un niveau auquel le blanchiment du fluorophore se produit progressivement.
Idéalement, pour chaque complexe assemblé, contrôlez la puissance du laser pour maintenir le taux de pas de blanchiment photo entre 10 et 20 images l’une de l’autre, comme décrit dans le manuscrit, et acquérir les images jusqu’à ce que toutes les molécules soient complètement photoblanchies. Effectuez une mesure d’assemblage dépendante du temps en commençant l’acquisition de films dès que l’échantillon est introduit dans la chambre et en acquérant de nouveaux films de photoblanchiment à intervalles de temps fixes après la fixation de la membrane à partir de différents segments du PEG SLB. La liaison de la cytolysine A aux membranes lipidiques avec cinq molaires pour cent DOPE-PEG (2000) a montré une densité de particules accrue et une saturation atteinte.
Une fonction de désintégration exponentielle ajustée aux particules liées donne la constante de temps pour la liaison de la membrane de cytolysine A. Sans polymère PEG dans la membrane, la plupart des traceurs présentaient une diffusion restreinte sur les SLB. De faibles niveaux de PEG 2000 dans la bicouche membranaire se sont éloignés de la surface sous-jacente, permettant aux molécules traceuses de diffuser sans contraintes de surface.
Cependant, un confinement extrême est observé à une concentration élevée de PEG dans la membrane bicouche. La distribution ISD2 pour la diffusion du traceur d’ADN lipophile dans deux membranes lipidiques PEG 2000 différentes a montré une diminution de la mobilité à des concentrations élevées de PEG. Après avoir incubé sur la membrane bicouche lipidique encombrée, la cytolysine A a présenté de nombreuses étapes de photoblanchiment distinctes, suggérant la formation de divers intermédiaires d’assemblage.
Après correction de l’efficacité du marquage, la distribution finale des oligomères a montré que l’espèce dodécamérique Cytolysin A était la structure dominante. L’assemblage de liaison aux protéines membranaires et d’autres réactions doivent être effectués dans des environnements d’encombrement membranaire appropriés. Une attention particulière doit être accordée au nettoyage de la chambre d’imagerie, à éviter de perturber la bicouche et à la mise en place du microscope TIRF.
