使用 体内 成像筛选哺乳动物宿主活动性感染期间 白色念珠 菌突变菌株的形态发生表型

白色念珠菌形态发生是由无数的环境信号触发的。通过研究体内形态发生，我们正在确定生物体如何整合和响应所有这些环境信号。该技术的主要优点是，它允许我们在没有可能使用体外模型系统引入的偏差或伪影的情况下研究形态发生。

很少有人有皮内注射的经验。我强烈建议刚接触这项技术的人联系他们的动物资源兽医，以帮助学习它。演示该程序的将是Rohan Wakade，我们实验室小组的博士后研究员。

首先通过在接种前至少七天喂食无叶绿素的食物来准备动物接种。注射前一天，用牙签从一个菌落中取一滴加拿大白色念珠菌细胞。接种25毫升YPD并重复此过程几次，以获得来自几个不同菌落的细胞。

将培养物在 30 摄氏度下以 175 RPM 的速度在轨道振荡器培养箱中孵育过夜。以500×g离心一毫升培养物两分钟，然后用一毫升无菌DPBS洗涤酵母三次。将沉淀重悬于一毫升无菌DPBS中，并将培养物稀释至1至100。

使用血细胞计数器计数细胞并相应地调整细胞密度。接下来，通过混合等体积的参考菌株和实验菌株来创建注射接种物。使用棉签，将非处方脱毛膏大量涂抹在麻醉动物双耳的内表面和外表面。

两到三分钟后，用干纱布轻轻擦拭耳朵，然后用浸有无菌水的纱布垫彻底去除脱毛膏残留物。用70%乙醇对耳朵表面进行消毒后，通过多次倒置小瓶或涡旋来充分混合接种物。将20至30微升接种物吸入胰岛素注射器中。

将针头保持在直立位置并轻轻敲击注射器，以确保桶中的任何空气都在顶部。小心地将空气和多余的接种物喷射回接种管或废液管中，使柱塞达到 10 微升标记。将柜台双面皮肤胶带敷在一个小圆锥形或圆底塑料管上，并将耳朵披在胶带上，避免麻醉鼻锥移位。

保持注射器针头几乎与皮肤平行并避免任何大静脉，将针尖插入皮肤的最外层，直到斜面刚好被覆盖，然后慢慢地将接种物皮内注射。良好的皮内注射会在皮肤上产生一个小气泡。将针头固定 15 到 20 秒，然后再将其从耳朵上取下，以尽量减少泄漏。

按照机构协议，用生物危害标签标记笼子，表明笼子里的动物感染了白色念珠菌。使用与制备接种物相同的洗涤培养物，在RPMI 1640中创建1至50稀释的细胞，补充10%的热量和活化的胎牛血清，并在37摄氏度下孵育4小时。使用显微镜检查样品。

计数至少100个细胞，记录每种菌株的酵母和丝状细胞的数量。将长工作距离物镜旋转到位，并在镜头上放置一滴浸没液。放下镜头以避免在放置盖玻片时可能损坏。

将 1.5 号盖玻片放在载物台开口上并将其粘贴到位。升起物镜，使浸没液与物镜和盖玻片接触。将麻醉鼻锥固定在显微镜载物台上，使其在成像时完全覆盖动物的鼻子。

将麻醉小鼠的鼻子放入鼻锥中。将一滴无菌水滴在物镜上方的盖玻片上。调整麻醉鼻锥并定位鼠标，使鼠标的耳朵位于水滴上方。

拿另一张盖玻片，将盖玻片的边缘平行于鼠标的身体放置，边缘接触鼠标耳朵与头部相接的地方。使用铰链运动，将盖玻片的自由边缘降低到显微镜载物台。当盖玻片贴在显微镜载物台上时，会使耳朵变平。

用胶带牢固地粘住顶盖滑，以保持足够的压力以保持耳朵平坦，并避免将鼠标的头发或胡须卡在胶带中。除非使用带有环境室的显微镜，否则请用无菌窗帘松散地覆盖小鼠的身体，以保持正常的热环境。使用白光，宽场成像，调整焦点平面进入耳组织，并聚焦在血管中移动的红细胞。

为了获得足够强的信噪比，以便可以确定视野中所有细胞的形态，请调整激光功率或成像速度。为避免组织损伤，请使用尽可能低的激光功率。选择一个在参考菌株中具有清晰细丝形成的视野，并且大多数生物体的分布足以确定其形态。

设置 Z 堆栈的焦点的顶部和底部平面。覆盖感染区域的整个深度不是必需的，但请记住，成像体积顶部或底部的生物通常被排除在分析之外。获取Z-stack图像，对每个通道进行伪着色以区分每个应变并覆盖通道。

保存图像。使用成像软件将Z堆栈最大投影到二维图像中。按菌株类型和形态计算最大投影图像中看到的每个生物。

参考菌株在体外迅速形成细丝。而EFG1 Null未能形成细丝。EFG1 Null在体内也表现出明显的灯丝缺陷。

大约9%的EFG1空细胞在体内以细丝形式生长。同样，与参考菌株相比，CYR1 Null突变菌株在体外显示出丝状缺陷。相比之下，53%的CYR1 Null突变细胞在体内以细丝形式生长。

由CYR1 Null突变体形成的细丝短于参考菌株。在接种过程中保持针头与皮肤平行至关重要。目标是将接种物放置在皮肤外层下方。

该技术还可以与在感兴趣的宿主细胞中表达荧光蛋白的小鼠品系一起使用，使我们能够研究体内宿主病原体的相互作用。