カンジダ・アルビカンスの形態形成は、無数の環境シグナルによって引き起こされます。in vivoで形態形成を研究することにより、生物がこれらすべての環境シグナルをどのように統合して応答するかを決定しています。この技術の主な利点は、in vitroモデルシステムを使用して導入される可能性のあるバイアスやアーティファクトがない場合に形態形成を研究できることです。
皮内注射の経験がある人はほとんどいません。このテクニックに不慣れな人は、動物資源の獣医に連絡して学習することを強くお勧めします。手順のデモンストレーションは、私たちの研究室グループのポスドクである若出ローハンです。
接種の前に少なくとも7日間クロロフィルフリーのチャウを与えることによって接種のために動物を準備することから始めます。注射の前日に、つまようじを使用して1つのコロニーからカナダのアルビカンス細胞を軽くたたきます。25ミリリットルのYPDを接種し、このプロセスを数回繰り返して、いくつかの異なるコロニーから細胞を取得します。
培養液を175RPMのオービタルシェーカーインキュベーターで摂氏30度で一晩インキュベートします。1ミリリットルの培養物を500 x gで2分間遠心分離し、次に1ミリリットルの滅菌DPBSで酵母を3回洗浄します。ペレットを1ミリリットルの滅菌DPBSに再懸濁し、培養液を1〜100に希釈します。
血球計算盤を使用して細胞をカウントし、それに応じて細胞密度を調整します。次に、参照株と実験株を等量混合して注射用の接種材料を作成します。綿の先端の綿棒を使用して、麻酔をかけた動物の両耳の内面と外面に市販の脱毛クリームをたっぷりと塗ります。
2〜3分後、乾いたガーゼで耳をそっと拭き、続いて滅菌水で飽和させたガーゼパッドで脱毛クリームの残留物を完全に取り除きます。耳の表面を70%エタノールで滅菌した後、バイアルを複数回反転させるか、ボルテックスして接種材料をよく混ぜます。20〜30マイクロリットルの接種材料をインスリン注射器に引き込みます。
針を直立位置に保持し、シリンジを軽くたたいて、バレル内の空気が上部にあることを確認します。空気と余分な接種材料を接種チューブまたは廃棄物チューブに慎重に排出して、プランジャーが10マイクロリットルのマークになるようにします。市販の両面スキンテープを小さな円錐形または丸底のプラスチックチューブに塗布し、麻酔のノーズコーンが外れないように、テープ全体に耳を垂らします。
注射針を皮膚とほぼ平行に保ち、大きな静脈を避け、針の先端を皮膚の最外層に挿入し、ベベルがちょうど覆われるまで、接種材料を皮内にゆっくりと注入します。良い皮内注射は皮膚に小さな泡を上げます。漏れを最小限に抑えるために、針を耳から外す前に、針を15〜20秒間所定の位置に保ちます。
制度上のプロトコルに従って、ケージ内の動物がカンジダアルビカンスに感染していることを示すバイオハザードラベルでケージにマークを付けます。接種材料の調製に使用したのと同じ洗浄培養物を使用して、RPMI 1640で1〜50希釈の細胞を作成し、10%熱および活性化ウシ胎児血清を添加し、摂氏37度で4時間タンブリングしながらインキュベートします。顕微鏡を使用してサンプルを調べます。
少なくとも100個の細胞をカウントし、各株について酵母および糸状細胞の数を記録します。作動距離の長い対物レンズを所定の位置に回転させ、液浸液の液滴をレンズに置きます。カバースリップを配置するときに起こりうる損傷を避けるために、レンズを下げてください。
1.5番のカバーをステージ開口部の上に滑り込ませ、所定の位置にテープで固定します。液浸液が対物レンズとカバースリップの両方に接触するように対物レンズを持ち上げます。麻酔ノーズコーンを顕微鏡ステージに固定して、イメージングの位置にいるときに動物の鼻を完全に覆うようにします。
麻酔をかけたマウスの鼻をノーズコーンに入れます。対物レンズの上のカバースリップに滅菌水を一滴置きます。麻酔のノーズコーンを調整し、マウスの耳が水滴の上にくるようにマウスを配置します。
別のカバースリップを取り、カバースリップの端をマウスの本体と平行に置き、耳が頭と出会う場所で端がマウスに触れるようにします。ヒンジモーションを使用して、カバースリップの自由端を顕微鏡ステージに下げます。カバースリップが顕微鏡ステージに当たると、耳が平らになります。
トップカバーのスリップをしっかりとテープで留めて、耳を平らに保ち、マウスの髪の毛やひげがテープに引っ掛からないようにするのに十分な圧力を保持します。環境チャンバーを備えた顕微鏡を使用しない限り、通常の熱環境を維持するために、マウスの体を滅菌ドレープでゆるく覆います。白色光、広視野イメージングを使用して、焦点面を耳の組織に調整し、血管内を移動する赤血球に焦点を合わせます。
視野内のすべての細胞について形態を決定できるように、十分に強い信号対雑音比を得るには、レーザー出力またはイメージング速度を調整します。組織の損傷を避けるために、可能な限り低いレーザー出力を使用してください。参照された株に明確なフィラメントが形成され、ほとんどの生物がそれらの形態を決定できるほど十分に広がっている視野を選択してください。
Z スタックのフォーカスの上面と下面を設定します。感染領域の深さ全体をカバーする必要はありませんが、画像ボリュームの上部または下部にある生物は通常、分析から除外されることに注意してください。Zスタック画像を取得し、各チャンネルを疑似色して各ひずみを区別し、チャンネルを重ね合わせます。
画像を保存します。イメージングソフトウェアを使用して、Zスタックを2次元画像に最大投影します。最大投影画像に見られる各生物を、菌株の種類と形態別にカウントします。
参照された株は、インビトロで急速にフィラメントを形成します。一方、EFG1ヌルはフィラメントの形成に失敗しました。EFG1ヌルは、生体内でも著しいフィラメント形成欠陥を示します。
EFG1ヌル細胞の約9%がin vivoでフィラメントとして増殖した。同様に、CYR1 Null変異株は、参照株と比較してインビトロでフィラメント形成障害を示した。対照的に、CYR1 Null変異細胞の53%は、生体内でフィラメントとして増殖した。
CYR1 Null変異体によって形成されたフィラメントは、参照株よりも短かった。接種中は針を皮膚と平行に保つことが重要です。目標は、接種材料を皮膚の外層のすぐ下に配置することです。
この技術は、目的の宿主細胞で蛍光タンパク質を発現するマウス系統でも使用でき、宿主病原体の相互作用をin vivoで研究することができます。
