Candida albicans morfogenezi, sayısız çevresel sinyal tarafından tetiklenir. Morfogenezi in vivo olarak inceleyerek, organizmanın tüm bu çevresel sinyallere nasıl entegre olduğunu ve tepki verdiğini belirliyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, in vitro model sistemleri kullanılarak tanıtılabilecek önyargı veya eserlerin yokluğunda morfogenezi incelememize izin vermesidir.
Çok az insan intradermal enjeksiyonlarla ilgili deneyime sahiptir. Bu teknikte yeni olan birinin, öğrenmesi için hayvan kaynakları veterinerine başvurmasını şiddetle tavsiye ederim. Prosedürü gösteren, laboratuvar grubumuzdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Rohan Wakade olacaktır.
Aşılamadan en az yedi gün önce klorofil içermeyen chow besleyerek hayvanı aşılamaya hazırlayarak başlayın. Enjeksiyondan bir gün önce, kürdan kullanarak bir koloniden Kanada albicans hücrelerinin bir kısmını alın. 25 mililitre YYPD aşılayın ve birkaç farklı koloniden hücre elde etmek için bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.
Kültürü, 175 RPM'de bir yörüngesel çalkalayıcı inkübatöründe gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. 500 x g'da iki dakika boyunca bir mililitre kültürü santrifüj edin, ardından mayayı bir mililitre steril DPBS ile üç kez yıkayın. Peleti bir mililitre steril DPBS'de yeniden askıya alın ve kültürü 1 ila 100'de seyreltin.
Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve buna göre hücre yoğunluğunu ayarlayın. Daha sonra, referans verilen ve deneysel suşun eşit hacimlerini karıştırarak enjeksiyon için inokulumu oluşturun. Pamuklu uçlu bir çubuk kullanarak, anestezi uygulanmış bir hayvanın her iki kulağının iç ve dış yüzeyine serbestçe reçetesiz satılan bir tüy dökücü krem uygulayın.
İki ila üç dakika sonra, tüy dökücü krem kalıntılarını iyice gidermek için kulağı kuru bir gazlı bezle ve ardından steril suya doyurulmuş gazlı bezlerle nazikçe silin. Kulakların yüzeyini% 70 etanol ile sterilize ettikten sonra, şişeyi birkaç kez ters çevirerek veya vorteksleyerek inokulumu iyice karıştırın. Bir insülin şırıngasına 20 ila 30 mikrolitre inokülum çekin.
İğneyi dik konumda tutun ve namludaki herhangi bir havanın üstte olduğundan emin olmak için şırıngaya hafifçe dokunun. Havayı ve fazla inokulumu, inokulum tüpüne veya bir atık tüpüne dikkatlice geri atın, böylece piston 10 mikrolitre işaretinde olur. Tezgahın üzerine çift taraflı cilt bandını küçük bir konik veya yuvarlak tabanlı plastik tüpe uygulayın ve anestezi burun konisinin yerinden çıkmasını önleyerek kulağı bant boyunca örtün.
Şırınga iğnesini cilde neredeyse paralel tutarak ve büyük damarlardan kaçınarak, iğnenin ucunu eğim sadece kaplanana kadar cildin en dış tabakasına yerleştirin ve inanguma yavaşça enjekte edin. İyi bir intradermal enjeksiyon ciltte küçük bir kabarcık oluşturacaktır. Sızıntıyı en aza indirmek için iğneyi kulaktan çıkarmadan önce 15 ila 20 saniye yerinde tutun.
Kurumsal protokolleri takiben, kafesteki hayvanlara Candida albicans bulaştığını gösteren biyolojik tehlike etiketleriyle kafesi işaretleyin. İnokulumu hazırlamak için kullanılan aynı yıkanmış kültürleri kullanarak, RPMI 1640'ta hücrelerin 1 ila 50 seyreltilmesini sağlayın,% 10 ısı ile desteklenir ve fetal sığır serumunu aktive eder ve dört saat boyunca yuvarlanma ile 37 santigrat derecede inkübe eder. Örneği mikroskop kullanarak inceleyin.
Her suş için maya ve filamentli hücrelerin sayısını kaydederek en az 100 hücre sayın. Uzun çalışma mesafesi hedefini yerine döndürün ve lensin üzerine bir damla daldırma sıvısı yerleştirin. Kapak kaymasını yerleştirirken olası hasarları önlemek için lensi indirin.
1,5 numaralı kapak kaymasını sahne açıklığının üzerine yerleştirin ve yerine bantlayın. Daldırma sıvısının hem objektif lens hem de kapak kayması ile temas halinde olması için hedefi yükseltin. Mikroskop aşamasında bir anestezi burun konisi, görüntüleme için pozisyondayken hayvanın burnunu tamamen kaplayacak şekilde sabitleyin.
Anestezi uygulanan bir farenin burnunu burun konisine yerleştirin. Objektif lensin üzerindeki kapak kaymasına bir damla steril su yerleştirin. Anestezi burun konisini ayarlayın ve fareyi, farenin kulağı su damlacığının üzerinde olacak şekilde konumlandırın.
Başka bir kapak kayması alın ve kapak kaymasının kenarını farenin gövdesine paralel olarak yerleştirin, kenar kulağın kafayla buluştuğu yere fareye dokunur. Bir menteşe hareketi kullanarak, kapak kaymasının serbest kenarını mikroskop aşamasına indirin. Kapak kayması mikroskop aşamasına karşı geldiğinden, kulağı düzleştirecektir.
Kulağı düz tutmak ve farenin saçını veya bıyıklarını bantta yakalamaktan kaçınmak için üst kapak kaymasını güvenli bir şekilde bantlayın. Çevre odasına sahip bir mikroskop kullanılmadığı sürece, normal bir termik ortamı korumak için farenin vücudunu steril bir örtü ile gevşek bir şekilde örtün. Beyaz ışık, geniş alan görüntüleme kullanarak, odak düzlemini kulak dokusuna ayarlayın ve kan damarlarında hareket eden kırmızı kan hücrelerine odaklanın.
Görüş alanındaki tüm hücreler için morfolojinin belirlenebilmesi için yeterince güçlü bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, lazer gücünü veya görüntüleme hızını ayarlayın. Doku hasarını önlemek için, mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanın. Referans alınan suşta net filament oluşumuna sahip ve çoğu organizmanın morfolojilerinin belirlenebileceği kadar yayıldığı bir görüş alanı seçin.
Bir Z-yığını için üst ve alt odak düzlemlerini ayarlayın. Enfekte alanın tüm derinliğini kaplamak gerekli değildir, ancak görüntülenen hacmin üstündeki veya altındaki organizmaların tipik olarak analizin dışında tutulduğunu unutmayın. Z-yığını görüntüleri alın, her bir suşu ayırt etmek ve kanalları kaplamak için her kanalı sahte renklendirin.
Görüntüleri kaydedin. Z-yığınının iki boyutlu bir görüntüye maksimum projeksiyonunu gerçekleştirmek için görüntüleme yazılımı kullanın. Maksimum projeksiyon görüntülerinde görülen her organizmayı gerinim tipine ve morfolojiye göre sayın.
Referans alınan suş hızla in vitro filamentler oluşturur. EFG1 Null ise filamentleri oluşturamadı. EFG1 Null, in vivo olarak da önemli bir filamentasyon kusuru sergiler.
EFG1 Null hücrelerinin yaklaşık% 9'u in vivo filamentler olarak büyüdü. Benzer şekilde, CYR1 Null mutant suşu, referans verilen suşa kıyasla in vitro bir filamentasyon defekti gösterdi. Buna karşılık, CYR1 Null mutant hücrelerinin% 53'ü in vivo filamentler olarak büyüdü.
CYR1 Null mutantı tarafından oluşturulan filamentler, referans alınan suştan daha kısaydı. Aşılama sırasında iğneyi cilde paralel tutmak çok önemlidir. Amaç, inokulumu cildin dış tabakasının hemen altına yerleştirmektir.
Bu teknik, ilgilenilen konakçı hücrelerde bir floresan proteini eksprese eden fare suşları ile de kullanılabilir, bu da konakçı patojen etkileşimlerini in vivo olarak incelememize izin verir.
