通过高通量微流体压缩系统对多细胞生物进行机械刺激

该协议解释了如何制造和使用微流体技术，以利用样品通量，自动处理以及精确施加机械应力的能力，同时可视化样品。该技术最大限度地减少了对多细胞生物有机体（如胚胎和类器官）的手动处理，以进行固定、比对和实时成像。它还能够将机械压缩应用于机械生物学研究。

使用传统的微加工技术，为这种微流控芯片制造具有高纵横比特征的模具可能具有挑战性。本视频文章中介绍的技巧可以克服这些挑战。首先，首先用丙酮清洁硅片，然后用异丙醇清洁。

将硅晶片放在 250 摄氏度的热板上 30 分钟。用于脱水烘烤。在蒸汽主炉中用六甲基二硅氧烷涂覆硅片。

将一瓶SU-8 2100光刻胶放入60摄氏度的烤箱中15分钟以降低其粘度。将一毫升加热的光刻胶倒入放置在热板上的每一英寸硅晶片，直到光刻胶覆盖大部分表面。首先以每分钟 250 转的速度应用预旋转，持续 30 秒，然后以每分钟 350 转的速度再应用预旋转，持续 30 秒，两者的加速度均为每秒 100 RPM。

接下来，首先以每分钟 500 转的速度应用旋转，持续 15 秒，每秒加速度为 100 RPM，然后以每秒 1， 450 转的速度旋转 30 秒，加速度为 300 RPM。用洁净室拭子取出边缘珠，并在晶圆上喷洒丙酮以去除瑕疵并促进均匀涂层。通过光掩模将硅胶晶圆暴露在每平方厘米350毫焦耳的紫外线下。

使用接触掩模对准器，将曝光后烘烤应用于硅晶圆，并使其冷却至室温。将烧杯放入另一个较大的烧杯中，并在较大的烧杯中填充新鲜的显影剂溶液。将金属网放在烧杯上。

将硅晶片倒置放在金属网上。在搅拌器打开的情况下，将硅晶片浸没在显影剂中 30 分钟。将硅晶片转移到装有新鲜显影剂的超声波浴超声仪中，以 40 千赫兹的速度进行一小时。

然后从烧杯中取出晶圆，并用新鲜的显影液清洗。通过将PDMS碱与固化剂以10:1的比例混合来制备预固化的PDMS溶液。通过将混合物放入室温下500g的离心机中5分钟来脱气。

将预固化的PDMS倒在硅晶片上，然后再次脱气。最后，将未固化的PDMS放入60摄氏度的烤箱中固化。使用手术刀切割与微流控芯片几何形状相对应的固化PDMS区域的边界。

使用活检打孔器或带有钝尖的针头在 PDMS 上打孔。等离子处理后，将PDMS放在载玻片上，其图案表面朝向载玻片，通过共价键密封微通道。允许俄勒冈-R成年苍蝇在苹果汁琼脂平板上产卵，并在给定实验产卵后的所需发育时间收集平板。

用胚胎蛋液淹没琼脂，并用画笔轻轻搅拌胚胎以将它们从琼脂中取出。将胚胎转移到50%漂白剂溶液中90秒，偶尔搅拌。通过组织筛过滤胚胎，并用水彻底洗去漂白剂溶液。

将胚胎转移到90毫米玻璃培养皿中，并带有足够的胚胎蛋液以完全覆盖胚胎。在解剖显微镜上用透照检查胚胎，并选择所需发育阶段的胚胎以加载到微流体装置中。通过主胚胎入口向所有七个胚胎微通道填充0.4微米的过滤IPA。

用0.4微米的过滤去离子水代替IPA。然后用胚胎蛋液代替去离子水。使用玻璃移液管从玻璃培养皿中收集大约 100 个预选胚胎。

接下来，将胚胎移液到胚胎入口，并使用便携式真空泵向气体入口施加大约三个PSI负压以打开胚胎微通道。然后将微流控芯片向下倾斜，使胚胎自动对齐并沉淀到胚胎微通道中。如果胚胎微通道入口被同时进入的多个胚胎堵塞，请将微流控芯片向上倾斜，然后再次向下倾斜以清除堵塞。

根据所需的吞吐量，将多达300个胚胎引入胚胎微通道。胚胎加载完成后，移除真空以固定胚胎。然后将微流控芯片倾斜回水平位置。

将带有压力表的便携式正压源连接到气体入口，以施加三个PSI压缩。如果要对机械刺激的胚胎进行实时成像实验，请将微流控芯片放在标准显微镜载物台玻璃载玻片支架上，气体入口连接到压力源。在微流体通道内的荧光显微镜下检查胚胎。

压缩实验完成后，可以收集胚胎进行下游分析。为此，首先，将真空施加到进气口以释放胚胎。然后将微流控芯片向上倾斜，使胚胎向下移动到胚胎引入口。

使用玻璃移液管从微流控芯片中收集胚胎。通过将果蝇胚胎加载到压缩通道中并向气体通道施加正压来实验确定微流体装置的功能。胚胎在真空下或中性压力状态下不会经历显着的压缩。

当施加正压时，它们被压缩。在显微镜下测量胚胎宽度减小的尺寸证明了如何使用气体压力来获得目标压缩水平。以这种方式制造的微流体装置允许对固定的样品进行化学刺激。

刺激允许高时空成像。发育生物学的一个基本问题是机械力如何在发育过程中调节蛋白质和基因表达？这项技术使我们能够一次对大量胚胎进行机械刺激，以便我们可以分离出足够量的蛋白质和RNA来进行比较蛋白质组学或转录组学实验。

这将使研究人员能够更多地了解对机械力敏感的蛋白质和基因。