Этот протокол объясняет, как изготавливать и использовать технологии микрофлюидики для использования экспериментальных преимуществ в пропускной способности образцов, автоматизированной обработке и способности точно применять механическое напряжение при одновременной визуализации образцов. Этот метод сводит к минимуму ручное обращение с многоклеточными биологическими организмами, такими как эмбрионы и органоиды, для их иммобилизации, выравнивания и живой визуализации. Это также позволяет применять механическую компрессию к ним для механобиологических исследований.
Изготовление пресс-форм с высоким соотношением сторон для этого микрофлюидного чипа может быть сложной задачей с обычными методами микропроизводства. Советы, описанные в этой видео-статье, могут преодолеть эти проблемы. Для начала очистите кремниевую пластину сначала ацетоном, а затем изопропиловым спиртом.
Поместите кремниевую пластину на конфорку с температурой 250 градусов Цельсия на 30 минут. для обезвоживания выпекать. Покрыть кремниевую пластину гексаметилдисилоксаном в паровой печи.
Поместите бутылку SU-8 2100 Photoresist в духовку с температурой 60 градусов Цельсия на 15 минут, чтобы уменьшить ее вязкость. Налейте один миллилитр нагретого фоторезиста на каждый дюйм кремниевой пластины, помещенной на конфорку, пока фоторезист не покроет большую часть поверхности. Применяйте предварительное вращение сначала со скоростью 250 оборотов в минуту в течение 30 секунд, а затем со скоростью 350 оборотов в минуту в течение еще 30 секунд, оба с ускорением 100 об/мин в секунду.
Затем примените вращение сначала при 500 оборотах в минуту в течение 15 секунд с ускорением 100 об/мин в секунду, а затем при 1 450 оборотах в минуту в течение 30 секунд с ускорением 300 об/мин в секунду. Удалите краевой шарик с помощью чистого комнатного тампона и распылите ацетон на пластину, чтобы удалить недостатки и способствовать равномерному покрытию. Подвергайте силиконовую пластину воздействию 350 миллиджоулей на сантиметр квадратного ультрафиолетового света через фотомаску.
С помощью выравнивателя контактной маски нанесите на кремниевую пластину после воздействия выпечку и дайте ей остыть до комнатной температуры. Поместите стакан внутрь другого более крупного стакана и наполните его новым решением для разработчиков. Поместите металлическую сетку на стакан.
Поместите кремниевую пластину на металлическую сетку вверх ногами. Оставьте кремниевую пластину погруженной в разработчика на 30 минут с включенной мешалкой. Переложите кремниевую пластину в ультразвуковой индикатор ванны, наполненный свежим разработчиком, в течение одного часа при 40 килогерцах.
Затем выньте пластину из стакана и вымойте ее свежим раствором разработчика. Приготовьте предварительно отвержденный раствор PDMS путем смешивания основания PDMS с отверждающим агентом в соотношении 10 к одному. Дегазировать смесь, поместив ее в центрифугу на 500 г в течение пяти минут при комнатной температуре.
Вылейте предварительно отвержденную PDMS на кремниевую пластину и снова дегазируйте ее. Наконец, поместите неотвержденный PDMS в печь с температурой 60 градусов Цельсия для отверждения. Используйте скальпель, чтобы вырезать границы отвержденной области PDMS, соответствующие микрофлюидной геометрии чипа.
Пробите входное и выходное отверстия на PDMS с помощью биопсийного перфоратора или иглы с тупым наконечником. Поместите PDMS на стеклянный слайд с его узорчатой поверхностью, обращенной к стеклянному слайду после плазменной обработки, чтобы запечатать микроканалы с помощью ковалентного склеивания. Позвольте взрослым мухам Oregon-R отложить яйца на тарелках с агаром из яблочного сока и собрать пластины в желаемое время развития после откладки яиц для данного эксперимента.
Насыпьте агар яйцом эмбриона и аккуратно перемешайте эмбрионы кистью, чтобы выбить их из агара. Перенесите эмбрионы в 50%-ный отбеливающий раствор на 90 секунд, периодически помешивая. Процедите эмбрионы через тканевое сито и тщательно смойте раствор отбеливателя водой.
Перенесите эмбрионы в 90-миллиметровую стеклянную чашку Петри с достаточным количеством эмбрионов, чтобы полностью покрыть эмбрионы. Исследуем эмбрионы с трансиллюминацией на рассекающем микроскопе, и отбираем эмбрионы нужной стадии развития для загрузки в микрофлюидное устройство. Праймируйте все семь микроканалов эмбрионов, заполнив их 0,4 микрометрами фильтрованного IPA через главный входной порт эмбриона.
Замените IPA на 0,4 микрометра отфильтрованной деионизированной воды. Затем замените воду DI раствором для мытья яиц эмбриона. Соберите около 100 предварительно отобранных эмбрионов из стеклянной чашки Петри с помощью стеклянной пипетки.
Затем пипетка эмбрионов во входной порт эмбриона и применяет примерно три отрицательных давления PSI к входу газа с помощью портативного вакуумного насоса, чтобы открыть микроканалы эмбриона. Затем наклоните микрофлюидный чип вниз, чтобы эмбрионы автоматически выровнялись и осели в микроканалах эмбриона. Если микроканальные входы эмбриона забиваются несколькими эмбрионами, входящими одновременно, наклоните микрофлюидный чип вверх, а затем снова вниз, чтобы очистить засорение.
Исходя из требуемой пропускной способности, введите до 300 эмбрионов в микроканалы эмбрионов. Как только загрузка эмбриона будет завершена, удалите вакуум, чтобы обездвижить эмбрионы. Затем наклоните микрожидкий чип обратно в горизонтальное положение.
Подключите портативный источник положительного давления с манометром к входному отверстию газа, чтобы применить три сжатия PSI. Если эксперименты с визуализацией в реальном времени будут проводиться на механически стимулированных эмбрионах, поместите микрофлюидный чип на стандартный стеклянный слайд-держатель для микроскопа с газовым входом, соединенным с источником давления. Исследуйте эмбрионы под флуоресцентным микроскопом внутри микрофлюидных каналов.
Как только эксперимент по сжатию завершен, эмбрионы могут быть собраны для последующего анализа. Для этого, во-первых, приложите вакуум к входному отверстию газа, чтобы освободить эмбрионы. Затем наклоните микрофлюидный чип вверх, чтобы эмбрионы двигались вниз к порту для введения эмбриона.
Соберите эмбрионы из микрофлюидного чипа с помощью стеклянной пипетки. Функциональность микрофлюидного устройства экспериментально определяли путем загрузки эмбрионов дрозофилы в компрессионные каналы и приложения положительного давления к газовым каналам. Эмбрионы не испытывают значительного сжатия в вакууме или в состояниях нейтрального давления.
Они сжимаются при положительном давлении. Измерения уменьшающейся ширины эмбрионов под микроскопом демонстрируют, как давление газа может быть использовано для получения целевого уровня сжатия. Микрофлюидные устройства, изготовленные таким образом, позволяют проводить химическую стимуляцию обездвиженных образцов.
Стимуляция позволяет проводить высокую пространственно-временную визуализацию. Фундаментальный вопрос в биологии развития заключается в том, как механические силы регулируют экспрессию белка и генов во время развития? Эта технология позволяет применять механическую стимуляцию к большому количеству эмбрионов одновременно, чтобы мы могли выделить достаточное количество белка и РНК для выполнения сравнительной протеомики или экспериментов по транскриптомике.
Это позволит исследователям узнать больше о белках и генах, которые чувствительны к механическим силам.
