이 프로토콜은 미세 유체 기술을 제작하고 사용하여 시료 처리량, 자동 처리 및 시료를 시각화하는 동시에 기계적 응력을 정확하게 적용하는 능력의 실험적 이점을 활용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 고정화, 정렬 및 라이브 이미징을 위해 배아 및 오가노이드와 같은 다세포 생물학적 유기체의 수동 취급을 최소화합니다. 또한 기계 생물학 연구를 위해 기계적 압축을 적용 할 수 있습니다.
이 미세 유체 칩에 대해 높은 종횡비 기능을 가진 금형을 제작하는 것은 기존의 미세 가공 기술로는 어려울 수 있습니다. 이 비디오 기사에서 설명하는 팁은 이러한 문제를 극복 할 수 있습니다. 시작하려면 실리콘 웨이퍼를 먼저 아세톤으로 청소 한 다음 이소 프로필 알코올로 청소하십시오.
실리콘 웨이퍼를 섭씨 250도 핫 플레이트에 30 분 동안 놓습니다. 탈수 베이크용. 실리콘 웨이퍼를 증기 프라임 오븐에서 헥사메틸디실록산으로 코팅합니다.
SU-8 2100 포토레지스트 한 병을 섭씨 60도 오븐에 15분 동안 넣어 점도를 낮춥니다. 포토레지스트가 표면의 대부분을 덮을 때까지 핫 플레이트에 놓인 실리콘 웨이퍼의 각 인치에 대해 가열된 포토레지스트 1밀리리터를 붓습니다. 먼저 분당 250 회전으로 30 초 동안 프리 스핀을 적용한 다음 초당 350 회전으로 30 초 동안 100 회전으로 초당 100RPM의 가속을 적용합니다.
다음으로, 초당 100RPM 가속으로 15 초 동안 분당 500 회전으로 스핀을 먼저 적용한 다음 초당 300RPM 가속으로 30 초 동안 분당 1, 450 회전으로 스핀을 적용하십시오. 클린룸 면봉으로 가장자리 비드를 제거하고 웨이퍼에 아세톤을 뿌려 결함을 제거하고 균일한 코팅을 촉진합니다. 실리콘 웨이퍼를 포토 마스크를 통해 센티미터당 350밀리줄의 정사각형 UV 광에 노출시킵니다.
접촉식 마스크 얼라이너를 사용하여 노출 후 베이크를 실리콘 웨이퍼에 적용하고 실온으로 식힙니다. 비커를 다른 큰 비커 안에 넣고 더 큰 비커에 새로운 현상액 용액을 채웁니다. 비커에 금속 메쉬를 놓습니다.
실리콘 웨이퍼를 금속 메쉬에 거꾸로 놓습니다. 교반기를 켠 상태에서 실리콘 웨이퍼를 현상액에 30분 동안 담가 두십시오. 실리콘 웨이퍼를 40 킬로 헤르츠에서 1 시간 동안 신선한 현상액으로 채워진 초음파 욕조 초음파 처리기로 옮깁니다.
그런 다음 비커에서 웨이퍼를 꺼내 새로운 현상액으로 씻으십시오. PDMS 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 사전 경화된 PDMS 용액을 준비합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 500 g의 원심분리기에 넣어 탈기시킨다.
사전 경화된 PDMS를 실리콘 웨이퍼에 붓고 다시 가스를 제거합니다. 마지막으로 경화되지 않은 PDMS를 섭씨 60도 오븐에 넣어 경화시킵니다. 메스를 사용하여 미세유체 칩 기하구조에 상응하는 경화된 PDMS 영역의 경계를 절단한다.
생검 펀치 또는 끝이 뭉툭한 바늘을 사용하여 PDMS의 입구 및 출구 구멍을 펀칭합니다. PDMS를 플라즈마 처리 후 패턴 표면이 유리 슬라이드를 향하도록 유리 슬라이드에 놓고 공유 결합을 통해 마이크로채널을 밀봉합니다. Oregon-R 성인 파리가 사과 주스 한천 접시에 알을 낳고 주어진 실험을 위해 알을 낳은 후 원하는 발달 시간에 접시를 수집하도록합니다.
한천에 배아 난자를 씻고 붓으로 배아를 부드럽게 저어 한천에서 제거합니다. 배아를 50 % 표백제 용액에 90 초 동안 옮기고 가끔 저어줍니다. 조직 체를 통해 배아를 변형시키고 표백제를 물로 완전히 씻어냅니다.
배아를 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 배아 난자 세척이 있는 90mm 유리 페트리 접시에 배아를 옮깁니다. 해부 현미경으로 형질 조사하여 배아를 검사하고 미세 유체 장치에 로딩하기 위해 원하는 발달 단계의 배아를 선택하십시오. 주 배아 입구 포트를 통해 0.4 마이크로미터의 여과된 IPA로 채워 7개의 배아 마이크로채널 모두를 프라이밍합니다.
IPA를 0.4마이크로미터의 여과된 탈이온수로 교체합니다. 그런 다음 DI 물을 배아 난자 세척 용액으로 교체하십시오. 유리 피펫을 사용하여 유리 페트리 접시에서 약 100 개의 미리 선택된 배아를 수집합니다.
다음으로, 배아를 배아 입구 포트 내로 피펫팅하고, 휴대용 진공 펌프를 사용하여 가스 유입구에 대략 3 PSI 음압을 가하여 배아 마이크로채널을 개방한다. 그런 다음 배아가 자동으로 정렬되고 배아 미세 채널에 정착하도록 미세 유체 칩을 아래쪽으로 기울입니다. 배아 마이크로 채널 입구가 동시에 들어가는 여러 배아에 의해 막히면 미세 유체 칩을 위쪽으로 기울인 다음 다시 아래로 기울여 막힘을 제거합니다.
필요한 처리량에 따라 최대 300개의 배아를 배아 마이크로채널에 도입합니다. 배아 로딩이 완료되면 진공을 제거하여 배아를 고정시킵니다. 그런 다음 마이크로 유체 칩을 다시 수평 위치로 기울입니다.
압력 게이지가 있는 휴대용 양압원을 가스 유입구에 연결하여 3개의 PSI 압축을 적용합니다. 기계적으로 자극된 배아에 대해 라이브 이미징 실험을 수행할 경우 가스 주입구가 압력 소스에 연결된 표준 현미경 스테이지 유리 슬라이드 홀더에 미세유체 칩을 놓습니다. 미세유체 채널 내부의 형광 현미경으로 배아를 검사합니다.
압축 실험이 완료되면 다운스트림 분석을 위해 배아를 수집할 수 있습니다. 이렇게하려면 먼저 가스 입구에 진공을 적용하여 배아를 자유롭게하십시오. 그런 다음 배아가 배아 도입 포트를 향해 아래쪽으로 이동하도록 미세 유체 칩을 위쪽으로 기울입니다.
유리 피펫을 사용하여 미세유체 칩으로부터 배아를 수집한다. 미세 유체 장치의 기능은 Drosophila 배아를 압축 채널에 넣고 가스 채널에 양압을 가함으로써 실험적으로 결정되었습니다. 배아는 진공 상태에서 또는 중성 압력 상태에서 상당한 압박을 경험하지 않습니다.
양압이 가해지면 압축됩니다. 현미경으로 배아의 감소하는 폭을 측정하면 가스 압력을 사용하여 목표 압축 수준을 얻는 방법을 알 수 있습니다. 이러한 방식으로 만들어진 미세 유체 장치는 고정 된 샘플의 화학적 자극을 허용합니다.
자극은 높은 시공간 이미징을 허용합니다. 발달 생물학의 근본적인 질문은 기계적 힘이 발달 중에 단백질과 유전자 발현을 어떻게 조절하는가입니다. 이 기술을 사용하면 한 번에 많은 수의 배아에 기계적 자극을 가할 수 있으므로 비교 단백질체학 또는 전사체학 실험을 수행하기에 충분한 양의 단백질과 RNA를 분리할 수 있습니다.
이를 통해 연구자들은 기계적 힘에 민감한 단백질과 유전자에 대해 더 많이 배울 수 있습니다.
