芸苔属疟原虫是土壤传播的强制性生物营养病原体，可攻击芸苔科植物。感染后，病原体会触发植物地下部分的瘿的发展，因此疾病马蹄根的名称。胆的发展伴随着非常复杂的重编程。
因此，跟踪疾病期间内部变化的可能性对于理解这种植物 - 病原体相互作用至关重要。我们的实验方案改善了复杂、厚胆和胆的成像。它简化了基因表达、生理反应、植物激素平衡、疾病进展、孢子分布和局部木质化变化的可视化。
该方案将荧光蛋白保留在样品中，允许长时间存储和处理物体。它还能够跟踪伴随疾病进展的生化和结构变化。演示该程序的将是Sara Blicharz，我们小组的博士后研究员，我们实验室的博士生Deeksha Singh和Adam Mickiewicz大学Agnieszka Bagniewska-Zadworna教授的博士生Kornel Michalak。
首先准备植物组织。小心地从马蹄根感染和未感染植物的根系中去除土壤。用水彻底清洁，并将下胚轴和胆收集到微量离心管中。
使用真空泵施加 700 毫巴的恒定真空，在室温下将样品固定在 200 至 500 微升多聚甲醛固定剂中一小时。确保物体完全浸入多聚甲醛溶液中。使用 4% 琼脂糖包埋未感染的下胚轴和感染的胆。
将溶液煮沸以溶解琼脂糖，并在冷却时倒入，同时它仍然粘稠。将物体在纸巾上轻轻干燥几秒钟，以去除多余的多聚甲醛。使用牙签或镊子将植物物体小心地嵌入琼脂糖中并定向。
为防止斜截面，请确保物体的方向和模制正确，使其轴线垂直于振动切片机刀片的平面。为了加速琼脂糖凝固，将培养皿或多培养板置于 4 摄氏度下 10 分钟。使用刀片，小心地在琼脂糖块内切割和成型物体，注意切片的首选方向。
使用氰基丙烯酸酯或即时胶水和遮蔽胶带将琼脂糖块或大胆粘在试样架上。根据胆的厚度和大小调整截面的厚度、速度和振动幅度。将蒸馏水加入水浴中，然后开始切片。
使用镊子或刷子小心地收集切片，并将它们转移到含有一毫升1X PBS缓冲液的微量离心管中。从微量离心管中取出1X PBS，并加入200至500微升的澄清溶液。如果在样品处理过程中一段时间后颜色发生变化，请用新的溶液替换清除溶液。
通过在澄清溶液中制备5%的钙氟白色染色剂，对输出植物细胞的细胞壁进行钙氟白色染色。然后将细胞在黑暗中染色至少五分钟。如文本手稿中所述，用尼罗河红染色脂质，用基本品红木质素染色木质素，并将清除的部分安装在显微镜载玻片上。
然后在落射荧光或共聚焦显微镜下观察细胞。使用多种采集模式同时对多个荧光光谱进行成像。在芸苔疟原虫定植的瘿中追踪疾病动态和病原菌积累，尼罗红染色后观察具有芸苔假单胞菌静止孢子的大细胞。
使用碱性品红染色观察芸苔属感染时木质部分化的变化。利用含有pHCA2：erRFP构建体的拟南芥植株来观察韧皮部组织中HCA2基因的表达。HCA2在芸苔苔苔藓驱动的胆发育后期与韧皮部共定位，基因活性反映了芸苔苔增加韧皮部复杂性的机制。
接种后16天，通过检查TCS：GFP标志物在发育中的胆中的表达来评估感染和未感染植物之间的差异细胞分裂素反应。细胞分裂素反应在受感染的瘿中似乎显着减少，而在未感染的植物中，它们仍然很强，特别是在韧皮部池中。最关键的步骤是固定PFA，包埋和切片。
对于振动切片机切片，需要优化并仔细调整速度、振幅和厚度参数，以获得高质量的切片。振动切片和组织清除技术为加强植物-微生物相互作用期间生理反应的显微镜分析以及表现出复杂细胞解剖结构的二次生长的组织铺平了道路。
