Plasmodiophora brassicae, Brassicaceae familyasından bitkilere saldıran toprak kaynaklı zorunlu biyotrofik patojendir. Enfeksiyon üzerine, patojen bitkinin yeraltı kısımlarında safraların gelişimini tetikler, bu nedenle hastalık kulüp kökünün adı. Safra keselerinin gelişimine çok karmaşık yeniden programlama eşlik eder.
Bu nedenle, hastalık sırasında iç değişiklikleri izleme olasılığı, bu bitki-patojen etkileşimini anlamak için çok önemlidir. Protokolümüz karmaşık, kalın ve safraların görüntülenmesini iyileştirir. Gen ekspresyonundaki, fizyolojik yanıtlardaki, fitohormon dengesindeki değişikliklerin, hastalık progresyonunun, spor dağılımının ve lokal lignifikasyonun görselleştirilmesini kolaylaştırır.
Protokol, numuneler içindeki floresan proteinleri koruyarak nesnelerin uzun süre depolanmasına ve işlenmesine izin verir. Ayrıca hastalığın ilerlemesine eşlik eden biyokimyasal ve yapısal değişikliklerin izlenmesini sağlar. Prosedürü gösteren, grubumuzdaki doktora sonrası araştırmacı Sara Blicharz, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Deeksha Singh ve Adam Mickiewicz Üniversitesi'ndeki Profesör Agnieszka Bagniewska-Zadworna grubundan doktora öğrencisi Kornel Michalak olacaktır.
Bitki dokusunu hazırlayarak başlayın. Toprağı kulüp kökü ile enfekte olmuş ve enfekte olmayan bitkilerin kök sistemlerinden dikkatlice çıkarın. Su ile iyice temizleyin ve hipokotilleri ve safra keselerini mikrosantrifüj tüplerine toplayın.
Bir vakum pompası kullanarak 700 milibarlık sabit bir vakum uygulayarak numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 ila 500 mikrolitre paraformaldehit fiksatif olarak sabitleyin. Nesnenin paraformaldehit çözeltisine tamamen daldırıldığından emin olun. Enfekte olmayan hipokotilleri ve enfekte safraları gömmek için% 4 agaroz kullanın.
Agarozu çözmek için çözeltiyi kaynatın ve hala viskoz iken soğuduğunda dökün. Fazla paraformaldehiti çıkarmak için nesneyi birkaç saniye boyunca bir doku üzerinde hafifçe kurulayın. Bitki nesnesini agaroza dikkatlice yerleştirmek ve yönlendirmek için kürdan veya forseps kullanın.
Eğik kesitleri önlemek için, nesnenin doğru yönlendirildiğinden ve kalıplandığından emin olun, böylece ekseni vibratom bıçağının düzlemine dik olacaktır. Agaroz katılaşmasını hızlandırmak için, 10 dakika boyunca dört santigrat derecede bir petri veya çok kültürlü bir plaka yerleştirin. Bir bıçak kullanarak, nesneyi bir agaroz bloğu içinde dikkatlice kesin ve kalıplayın, kesitleme için tercih edilen yönü not edin.
Siyanoakrilat veya anlık yapıştırıcı ve maskeleme bandı kullanarak numune tutucuya düzgün bir şekilde monte etmek için agaroz bloğunu veya büyük safrayı yapıştırın. Kesitlerin kalınlığını, hızını ve titreşim genliğini safra kesesinin kalınlığına ve boyutuna göre ayarlayın. Su banyosuna damıtılmış su ekleyin ve bölümleme ile başlayın.
Forseps veya fırça kullanarak bölümleri dikkatlice toplayın ve bunları bir mililitre 1X PBS tamponu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Mikrosantrifüj tüpünden 1X PBS'yi çıkarın ve 200 ila 500 mikrolitre temizleme çözeltisi ekleyin. Numune işleme sırasında bir süre sonra rengi değişirse temizleme solüsyonunu yenisiyle değiştirin.
Temizleme çözeltisinde kalkoflor-beyaz lekenin% 5'ini hazırlayarak giden bitki hücrelerinin hücre duvarları için kalkoflor-beyaz boyama yapın. Daha sonra hücreleri karanlıkta en az beş dakika boyunca lekeleyin. Nil kırmızısı leke lipitleri ve metin el yazmasında açıklandığı gibi Temel Fuchsin lignin boyaması ile ligninler ve temizlenmiş bölümleri mikroskopi slaytına monte edin.
Daha sonra hücreleri bir epifloresan veya konfokal mikroskop altında gözlemleyin. Aynı anda birden fazla floresan spektrumunu görüntülemek için birden fazla yakalama modu kullanın. Plasmodiophora brassicae tarafından kolonize edilen safra keselerinde hastalık dinamikleri ve patojen birikimi izlendi ve Nil kırmızısı boyamasından sonra P.brassicae dinlenme sporları olan büyük hücreler gözlendi.
P.brassicae enfeksiyonu üzerine ksilem farklılaşmasındaki değişiklikler Temel Fuchsin boyama kullanılarak görselleştirildi. pHCA2: erRFP yapısını barındıran Arabidopsis bitkileri, clubroot safralarındaki floem dokusunda HCA2 gen ekspresyonunu görselleştirmek için kullanıldı. HCA2, P.brassicae güdümlü safra gelişiminin geç aşamalarında floem ile birlikte lokalize olur ve gen aktivitesi, P.brassicae'nin floem karmaşıklığını arttırdığı mekanizmayı yansıtmıştır.
Aşılamadan sonraki 16 günde, enfekte olmuş ve enfekte olmayan bitkiler arasındaki diferansiyel sitokinin yanıtları, gelişmekte olan safralarda TCS: GFP belirtecinin ekspresyonu kontrol edilerek değerlendirildi. Sitokinin yanıtları, enfekte olmuş safralarda önemli ölçüde azalırken, özellikle floem havuzunda, enfekte olmayan bitkilerde güçlü kalmıştır. En kritik adımlar PFA'da sabitleme, gömme ve kesitlemedir.
Vibratom kesiti için, kaliteli bölümler elde etmek için hız, genlik ve kalınlık parametrelerini optimize etmek ve dikkatlice ayarlamak gerekir. Vibratom kesitleme ve doku temizleme teknikleri, bitki-mikrop etkileşimleri sırasında fizyolojik tepkilerin mikroskobik analizini ve karmaşık hücresel anatomi ile ikincil büyüme gösteren dokuları arttırmanın yolunu açmıştır.
