鼻自组装纳米乳肿瘤疫苗体外和体内的制备、特性、毒性及疗效评价

新型纳米乳疫苗在疾病策略治疗中具有很大的优势。这些集合效应通过独特的肿瘤切碎、特定策略的鉴定和低全身毒性等特性而最小化。我们预计该方案将为新型T细胞ectype肽粘膜疫苗的未来开发提供技术和理论线索。

首先将一毫克单磷脂质A与100微升DMSO混合。涡旋五分钟，在室温下溶解四小时。定量添加吐温80和I-OVA。

混合成分并加入角鲨烯。接下来，向制备的混合物中加入100微升MPLA溶液。为了制备纳米乳液疫苗，将混合溶液以大约占总体积的70%加入水滴中，轻轻搅拌以获得透明且易于流动的混合物。

对于体外测定，从恢复BEAS2B上皮细胞开始。打开水浴并将温度调节到37摄氏度。在水浴中快速解冻冷冻细胞瓶，在37摄氏度下回火。

解冻后，将细胞快速移液到15毫升无菌离心管中，并加入两毫升完整的生长培养基。将试管以 129 G 离心五分钟。除去舒嘎吱并将细胞重悬于两毫升完全生长培养基中。

再次离心细胞后，除去脱敏剂并加入六毫升完全生长培养基以重悬细胞。然后将细胞转移到T25培养瓶中，并在5%二氧化碳培养箱中以37摄氏度孵育。一旦细胞密度达到80%至90%，丢弃培养基并用两毫升PBS洗涤细胞两次。

加入一毫升0.25%tripsin以消化细胞一到两分钟。当观察到细胞变圆时，立即加入四毫升完整的生长培养基以中和胰蛋白酶。在15毫升无菌离心管中混合并吸出样品。

将样品以 129 G 离心五分钟。取出舒替，将细胞重悬于一毫升RPMI 1640完全培养基中。使用20微升细胞悬液进行细胞计数，并将细胞稀释至每毫升10至第五个细胞的1倍。

然后将BEAS2B细胞以每孔10倍至第四个细胞的密度接种在100微升RPMI 1640完全培养基中的96孔板中，并将板预孵育24小时如前所述。在孵育结束时，丢弃嘀嘀嗒，并向96孔板的每个孔中加入100微升RPMI 1640。加入I-OVA纳米乳液各100微升，I-OVA与BNE混合，I-OVA用各种终浓度的完全生长培养基预稀释，BNE作为对照，并在37摄氏度下孵育24小时。

孵育完成后，取出培养基，然后将板转移到黑暗的地方。向板的每个孔中加入90微升完全生长培养基和10微升CCK8溶液。将板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育两小时。

使用酶标记的酶标仪在450纳米处测量每个孔的吸光度。使用10微升移液器吸头对小鼠进行I-OVA，I-OVA加BNE和I-OVA NE的鼻免疫三天。使用BNE和PBA作为实验对照。

之后，用剪刀切割约三毫米厚的鼻组织样本，并将它们放入4%多聚甲醛中。取出肺组织，将鼻和整个肺组织固定在4%多聚甲醛中24小时。TEM和AFM用于评估纳米疫苗表面zeta电位和粒径的基本特性。

显示了I-OVA NE在穆辛稳定性分析中的粒径、多分散指数、zeta电位和电泳迁移率。BEAS2B 细胞的相对活力在暴露于不同肽浓度的 I-OVA、BNE+I-OVA 和 I-OVA NE 24 小时的培养物中超过 80%。I-OVA EN组无明显的黏膜毒性、组织损伤、出血或炎症细胞浸润。

上皮BEAS2B细胞捕获的FITC标记的I-OVA NE比其水溶液更多。采用IV-IS系统分析I-OVA NE体外缓释效果。与I-OVA的水溶液相比，I-OVA NE疫苗具有缓释作用。

在I-OVA NE组中，存活时间百分比高于其他组，肿瘤体积明显较小，表明其比其他组具有更好的预防保护效果。在治疗模型中，不同组之间的中位生存时间显着不同。I-OVA NE组的肿瘤体积明显小于I-OVA组。

在这个过程中，均匀搅拌混合物很重要。否则会降低纳米疫苗的效率。