A nova vacina em nanoemulsão apresenta grandes vantagens na terapia tática da doença. Esses efeitos são minimizados por propriedades como o chopismo tumoral único, a identificação de táticas específicas e a baixa toxicidade sistêmica. Antecipamos que o protocolo fornecerá pistas técnicas e teóricas para o desenvolvimento futuro de novas vacinas de mucosa de peptídeos ectipo de células T.
Comece misturando um miligrama de lipídio monofosforol A com 100 microlitros de DMSO. Vórtice por cinco minutos e deixe dissolver por quatro horas em temperatura ambiente. Adicione quantitativamente TWEEN 80 e I-OVA.
Misture os componentes e adicione esqualeno. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de MPLA à mistura preparada. Para preparar a vacina de nanoemulsão, adicione a solução misturada às gotículas de água a aproximadamente 70% do volume total e mexa suavemente para obter uma mistura transparente e de fácil fluidez.
Para ensaios in vitro, comece com a reanimação das células epiteliais BEAS2B. Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Descongele os frascos de células congeladas rapidamente em banho-maria, temperado a 37 graus Celsius.
Após o descongelamento, pipetar rapidamente as células em um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros e adicionar dois mililitros do meio de crescimento completo. Centrifugar o tubo a 129 G durante cinco minutos. Remova o supinatant e ressuspenda as células em dois mililitros do meio de crescimento completo.
Depois de centrifugar as células mais uma vez, remova o supinatant e adicione seis mililitros de meio de crescimento completo para ressuspender as células. Em seguida, transfira as células para um frasco de cultura T25 e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%. Quando a densidade celular atingir 80% a 90%, descarte o meio de cultura e lave as células duas vezes com dois mililitros de PBS.
Adicione um mililitro de 0,25% de tripsina para digerir as células por um a dois minutos. Quando o arredondamento das células é observado, adicione imediatamente quatro mililitros do meio de crescimento completo para neutralizar a tripsina. Misture e aspirar as amostras em um tubo centrífugo estéril de 15 mililitros.
Centrifugar as amostras a 129 G durante cinco minutos. Retire o supinatant e ressuspenda as células em um mililitro de meio completo RPMI 1640. Use 20 microlitros da suspensão celular para contagem de células e dilua as células para uma vez 10 a quinta células por mililitro.
Em seguida, plaquear as células BEAS2B a uma densidade de uma vez 10 a quarta células por poço em placas de 96 poços em 100 microlitros de meio completo RPMI 1640 e pré-incubar as placas por 24 horas, como demonstrado anteriormente. Ao final da incubação, descarte o supinatant e adicione 100 microlitros de RPMI 1640 a cada poço da placa de 96 poços. Adicionar 100 microlitros cada de nanoemulsão I-OVA, I-OVA misturado com BNE e I-OVA pré-diluído com um meio de crescimento completo em várias concentrações finais com BNE como controle e incubar por 24 horas a 37 graus Celsius.
Quando a incubação estiver completa, remova o meio e transfira a placa para um local escuro. Adicione 90 microlitros de meio de crescimento completo e 10 microlitros de solução CCK8 a cada poço da placa. Incubar a placa por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Meça a absorbância de cada poço a 450 nanômetros usando um leitor de placas marcado com enzima. Use pontas de pipeta de 10 microlitros para realizar a imunização nasal dos camundongos com I-OVA, I-OVA mais BNE e I-OVA NE por três dias. Utilizar BNE e PBA como controle experimental.
Em seguida, cortar amostras de tecidos nasais com tesoura de aproximadamente três milímetros de espessura e colocá-las em paraformaldeído a 4%. Remover os tecidos pulmonares e fixar os tecidos nasais e pulmonares inteiros em paraformaldeído a 4% por 24 horas. MET e AFM são utilizados para a avaliação de características básicas do potencial zeta de superfície e do tamanho de partícula da nanovacina.
Tamanhos de partículas, índices de polidispersidade, potenciais zeta e mobilidade eletroforética do I-OVA NE em análises de estabilidade de musina são mostrados. A viabilidade relativa das células BEAS2B é superior a 80% em culturas expostas a diferentes concentrações peptídicas de I-OVA, BNE+I-OVA e I-OVA NE por 24 horas. O grupo I-OVA EN não apresentou toxicidade óbvia da mucosa, dano tecidual, sangramento ou infiltração de células inflamatórias.
As células epiteliais BEAS2B capturaram mais I-OVA NE marcadas com FITC do que a solução aquosa. O efeito de liberação sustentada do I-OVA NE in vitro foi analisado usando o sistema IV-IS. A vacina I-OVA NE teve um efeito de liberação sustentada em comparação com a solução aquosa de I-OVA.
No grupo I-OVA NE, o tempo percentual de sobrevida é maior em comparação com outros grupos, e o volume tumoral foi significativamente menor, sugerindo que tem um melhor efeito preventivo de proteção do que os outros grupos. No modelo terapêutico, a mediana do tempo de sobrevida foi significativamente diferente entre os diferentes grupos. O volume tumoral do grupo I-OVA NE foi significativamente menor do que o do grupo I-OVA.
Mexer a mistura uniformemente é importante neste procedimento. Caso contrário, reduzirá a eficiência das nanovacinas.
