为了减少动物试验，并由于NH试验的变异性，世卫组织鼓励制定体外方法，评估狂犬病疫苗的功效。此 ELISA 测试显示与经典 NH 测试在识别糖蛋白的免疫原性形式方面良好一致，表现出高灵敏度，且只能在一天内完成。ELISA对狂犬病疫苗在体外效力的评价是体内NH试验的替代方案。
它由制造商和国家控制实验室推广。每次稀释时，必须按重复的体积分发预尺寸的卷，并在洗涤后将盘子干燥在吸水纸上，以避免开始此过程，安装足够的个人防护设备，包括一次性外套、手套、面罩和眼镜。将受污染的材料浸入2.6%次氯酸钠溶液中，30分钟进行净化，对受污染的材料进行处理。
接下来，设置一个96井的免疫测定板，并添加200微升的单克隆抗体稀释在每一个井的碳酸盐缓冲液。用胶粘膜盖住板，在加湿环境中在37摄氏度下孵育微孔板3小时。然后小心吸气，将井内含量转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的接收方中。
反转微孔板，在室温下在吸水纸上干燥五分钟。首先，向每井添加300微升钝化缓冲液。用胶粘膜盖住盘子，在37摄氏度下孵育30分钟。
在此之后，将井内装物转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的井中。要清洗盘子，请在每个井中加入300微升的洗涤缓冲液。然后小心吸气，将井内含量转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的接收方中。
再重复此洗涤过程五次，以广泛清洗敏感板。在此之后，反转微孔板，让它在室温下在一块吸水纸上干燥一分钟。在一毫升蒸馏水中重组参考疫苗，使狂犬病病毒糖蛋白的最终浓度为每毫升10微克。
在稀释剂中准备10倍稀释重组参考疫苗，以达到狂犬病病毒糖蛋白浓度每毫升1微克。接下来，如文本协议表之一所述，在稀释剂中对该参考疫苗进行六次连续的两倍稀释。在重复井中分配200微升稀释剂，作为盲控，每口200微升用于重复的参考疫苗稀释。
然后在稀释剂中准备10倍的稀释测试疫苗，并准备七倍的稀释剂的稀释剂，如文本协议表二所述。将每个测试的疫苗稀释的 200 微升重复分发到微孔板的每个孔中。用胶粘膜盖住微孔板，在37摄氏度下孵育一小时。
在此之后，取出薄膜。小心吸气，将每一井的含量转移到含有2.7%次氯酸钠溶液的接受者中。要清洗盘子，在每一个井中加入300微升的洗涤缓冲液，小心吸气，并将每一井的内含物转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的接受者中。
再重复洗涤过程五次，去除未绑定的抗原，并保存与涂层抗体结合的 G 蛋白修剪剂。倒置洗涤的微孔板，让它在室温下在一块吸水纸上干燥一分钟。然后将推荐的200微升的过氧化物酶的稀释剂（标有D1单克隆抗体）在稀释剂中分配到每井。
用胶粘膜盖住微孔板，在37摄氏度下孵育一小时。接下来，取出薄膜，小心吸气，将每一井的含量转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的接受者中。要清洗微孔板，请在每个孔中加入300微升的洗涤缓冲液。
小心吸气，将每一井的含量转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的接受者中。重复此洗涤过程五次，以去除未绑定过氧化物酶标记的抗体。倒置洗涤的微孔板，让它在室温下在一块吸水纸上干燥一分钟。
接下来，将200微升基基铬质溶液分配到每一个井中。用薄膜密封微孔板，在黑暗中室温下孵育30分钟。然后在每个井中加入50微升的停止溶液，以停止反应。
小心地擦拭微孔板的底部，并放在分光光度计中。确定所有使用油井的光学密度为 492 纳米。在电子表格文件中收集此数据以进行分析。
在此之后，为参考疫苗曲线和文本协议中概述的光学密度值创建绘图。在这项研究中，体外ELISA测试用于评估狂犬病疫苗的功效。此处显示了典型实验中的代表性光学密度值。
这些值用于绘制参考疫苗曲线，通过绘制垂直轴上参考疫苗的不同稀释和水平轴上糖蛋白浓度的不同稀释度均值光学密度。然后使用此曲线估计被测试疫苗的糖蛋白含量。对于参考疫苗曲线的衬里区域具有平均光学密度值的稀释值，评估是精确的。
考虑到1至40的稀释，X轴上的OD 1534的垂直投影相当于每毫升500毫微克。因此，测试的疫苗估计为每毫升糖蛋白20微克。在确定体外效力时，有必要将经检测的疫苗与在国际单位中校准的世卫组织六项国际标准进行比较。
同样的方法可以与其他抗体一起使用，以扩大对更多疫苗株的检测，包括那些用于兽医疫苗的疫苗，这些疫苗通常更具有变数。抗体也可用于竞争在马或人血清中滴定抗狂犬病抗体。对未灭活或病毒的疫苗必须采取预防措施。
请务必使用个人防护设备，戴上手套，并正确净化所有物品。此外，要小心片剂，因为它们是致癌的和酸钠次氯酸盐溶液。
