研究体外和细胞荧光适配体动力学使用户能够评估适配体染料相互作用是否足够快，可以实时研究感兴趣的过程。所介绍的技术允许在细胞内部和外部进行定量动力学测量，根据适配体的应用，其中任何一种都可能相关。所介绍的方法可应用于任何荧光RNA系统，包括替代适配体和基于RNA的小分子生物传感器。
首先，从热循环仪设置RNA复性程序。通过选择创建新程序创建程序“添加新阶段”并添加新步骤“多次添加特定于温度的步骤，然后按保存”根据程序调整其他设置。要使菠菜二和西兰花RNA变性，请在0.5毫升薄壁PCR管中的双蒸水中制备每种RNA的两微摩尔茎。
然后加入等体积的两倍复性缓冲液，制成一微摩尔RNA溶液。将试管放入热循环仪中。打开保存的复性程序并按运行“接下来，设置酶标仪进样器程序。
在荧光酶标仪上，选择温度“并将其设置为37摄氏度。在开始动力学之前，请确保温度已平衡到此值。打开酶标仪软件。
选择设置“然后采集视图”要输入动力学测量程序，请选择循环“对于每个孔。接下来，将基线设置设置为 60 个基线读数，并将智能注射设置设置为 10 微升注射。将荧光读数激发波长设置为 448 纳米，将发射波长设置为 506 纳米，将墨盒设置为单声道。
将总读取时间设置为 10 分钟，读取间隔为 0.5 秒。将 PMT 和光学元件设置为每次读取六次闪光。然后输入循环到下一个井。
要准备酶标器进样器，请在读板器上选择进样器“，并根据指示提供废物收集板。然后选择“洗涤”并按照酶标仪上的说明用一毫升体积的双蒸水，75%乙醇和蒸馏水清洁注射管。接下来选择吸气“允许注射器喷射多余的液体。
然后选择prime“用两个260微升的100微摩尔D F H B灌注进样器 I.To 进行一次动力学实验，将80微升结合缓冲液预混液加入到96孔透明底板的一个孔中。然后加入10微升变性RNA。让板和进样器中的 D F H B I 溶液平衡至 37 摄氏度 15 分钟。
接下来，在读取区域下的软件设置中选择要分析的孔。然后在主页选项卡下，选择运行“以执行前面描述的动力学程序。重复此过程，直到所有实验完成。
运行后，如前所述，清洗进样器以从注射管中取出剩余的D F H B I溶液。要设置实验文件，请打开流式细胞仪和计算机。在实验资源管理器选项卡中创建一个新文件，方法是右键单击流式细胞仪“用户名。
然后选择“新建实验”在下拉窗口中，当计算机屏幕上弹出一个新窗口时，选择实验类型为试管“然后选择确定”在新实验文件中右键单击组文件夹并选择添加新样品管“标记每个特定时间点的样品管并通过右键单击样品进行复制”并选择重命名“在下拉菜单中。接下来，通过在培养管中的AI培养基中加入1.5毫升1 X P B S和3微升诱导细胞来制备稀释的细胞溶液。在添加染料之前，测量细胞的背景荧光，以观察折叠随时间推移而打开。
加入染料后，将含有P B S细胞的培养管放入样品管升降器中，并将升降器抬高到样品注射针上。然后在收集面板选项卡中选择适当的样品文件并单击记录“运行完成后，用手用培养管降低样品管升降机。启动冲洗步骤，冲洗流体系统，并最大限度地减少每个生物重复样品之间的残留。
要移动到以下样品，请单击记录图标下样品管名称附近的右箭头图标，选择下一个示例文件。要用染料测量细胞的荧光，将1.4微升浓缩染料原液加入一个带有细胞的X P B S中，得到终浓度为50微摩尔D F H B I ONE T.固定培养管盖并倒置三至五次以使溶液均匀混合。接下来，取下盖子并将培养管放入样品管升降器中。
将支架抬高到样品进样针头后，单击正确样品文件下的记录“图标。然后，通过按开始开始定时器“荧光适配体菠菜二和西兰花的体外动力学，显示用于结合D F H B I染料的两相缔合动力学。对于这两种核酸适配体，在较长的测量时间内，两相关联比单相结合的动力学数据拟合得更好。
最佳拟合曲线决定了快速和慢速关联的速率常数和半衰期值。菠菜二处于结合能力状态，显示出比西兰花更快的开启。两种核酸适配体的第二相动力学相似，可能对应于一个共同的限速步骤。
核酸适配体动力学曲线由相似程度的快速结合RNA组成。对于表达菠菜两个T RNA的细胞，平均荧光强度或M F I在零时间点立即增加。此外，细胞荧光在五分钟内达到其最大平衡M F I值。
相比之下，对照细胞显示出低背景荧光，并且在D M S O添加的情况下M F I值没有变化。 所提出的方法使研究人员能够确定如何更快地在荧光适配体中制造基于RNA的传感器。
