Vitro ve hücresel florojenik aptamer kinetiğinde çalışmak, kullanıcının aptamer boya etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak ilgilenilen bir süreci incelemek için yeterince hızlı olup olmadığını değerlendirmesini sağlar. Sunulan teknikler, hücrenin hem içinde hem de dışında nicel kinetik ölçümlere izin verir; bunlardan herhangi biri, aptamerin uygulanmasına bağlı olarak ilgili olabilir. Sunulan yöntemler, alternatif aptamerler ve küçük moleküller için RNA tabanlı biyosensörler de dahil olmak üzere herhangi bir florojenik RNA sistemine uygulanabilir.
Başlamak için, termosiklustan RNA renatürasyon programını ayarlayın. Yeni program oluştur"yeni aşama ekle" ve yeni adım ekle" yi seçerek programı oluşturun, kaydetmeden önce sıcaklığa özgü adımlar eklemek için birden çok kez"Programa göre ek ayarları yapın. Ispanak iki ve brokoli RNA'larını yeniden denatüre etmek için, her RNA'nın iki mikromolar sapını 0.5 mililitrelik ince duvarlı bir PCR tüpünde çift damıtılmış suda hazırlayın.
Daha sonra bir mikromolar RNA çözeltisi yapmak için eşit hacimlerde iki x renatürasyon tamponu ekleyin. Tüpleri termosiklusun içine yerleştirin. Kaydedilen renatürasyon programını açın ve çalıştır tuşuna basın"Ardından, plaka okuyucu enjektör programını ayarlayın.
Floresan plaka okuyucusunda sıcaklığı seçin "ve 37 santigrat dereceye ayarlayın. Kinetik çalışmaya başlamadan önce, sıcaklığın bu değere eşit olduğundan emin olun. Plaka okuyucu yazılımını açın.
Kinetik ölçümler için programı girmek üzere ayarları "ardından edinme görünümünü" seçin, her kuyucuk için "döngü" yü seçin. Ardından, 10 mikrolitrelik enjeksiyon için taban çizgisi ayarını 60 taban çizgisi okuması ve akıllı enjeksiyon ayarları olarak ayarlayın. Floresan uyarım dalga boyunu 448 nanometreye, emisyon dalga boyunu 506 nanometreye ve kartuşu monoya ayarlayın.
Toplam okuma süresini 0,5 saniyelik okuma aralığıyla 10 dakika olarak ayarlayın. PMT ve optikleri okuma başına altı flaşa ayarlayın. Ardından bir sonraki kuyuya döngü girin.
Plaka okuyucu enjektörünü hazırlamak için "plaka okuyucusuna enjekte et" i seçin ve yönlendirildiğinde bir atık toplama plakası sağlayın. Ardından yıkamayı seçin ve plaka okuyucudaki talimatları izleyerek enjeksiyon tüpünü bir mililitre hacimde çift damıtılmış su,% 75 etanol ve ardından damıtılmış su ile temizleyin. Daha sonra aspiratı seçin", enjektörün fazla sıvıyı çıkarmasına izin verin.
Ardından, enjektörün iki adet 260 mikrolitre 100 mikromolar D F H B ile astarlanması I.To bir kinetik deneyi gerçekleştirmesi için prime" i seçin, 96 iyi temizlenmiş bir alt plakanın bir kuyucuğuna 80 mikrolitre bağlayıcı tampon ana karışımı ekleyin. Sonra 10 mikrolitre renatüre RNA ekleyin. Enjektördeki plaka ve D F H B I çözeltisinin 15 dakika boyunca 37 santigrat dereceye dengelenmesine izin verin.
Ardından, okuma alanının altındaki yazılım ayarlarında analiz edilecek kuyuyu seçin. Ardından, ana sayfa sekmesinin altında, daha önce açıklanan kinetik programını yürütmek için "çalıştır" ı seçin. Tüm denemeler tamamlanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
Çalıştırmadan sonra, kalan D F H B I çözeltisini daha önce gösterildiği gibi enjeksiyon tüpünden çıkarmak için enjektörü yıkayın. Deneysel dosyaları ayarlamak için akış sitometresini ve bilgisayarı açın. Akış sitometresi"kullanıcı adını sağ tıklayarak deneme gezgini sekmesinde yeni bir dosya oluşturun.
Ardından, açılır pencerede "yeni deneme"yi seçin ve bilgisayar ekranında yeni bir pencere açıldığında, tüp olarak deneme türünü seçin" ve ardından Tamam'ı seçin"Yeni deney dosyasında grup klasörüne sağ tıklayın ve yeni örnek tüpü ekle'yi seçin"Her belirli zaman noktası için örnek tüpleri etiketle ve örneğe sağ tıklayarak çoğalt" ı seçin ve açılır menüden "yeniden adlandır" ı seçin. Daha sonra, bir kültür tüpünde AI ortamına 1,5 mililitre bir X P B S ve üç mikrolitre indüklenmiş hücre ekleyerek seyreltilmiş bir hücre çözeltisi hazırlayın. Boya eklemeden önce, kıvrımın zamanla açıldığını gözlemlemek için hücrelerin arka plan floresansını ölçün.
Boya eklendikten sonra, P B S'deki hücreleri içeren kültür tüpünü numune tüp kaldırıcıya yerleştirin ve kaldırıcıyı numune enjeksiyon iğnesine kaldırın. Ardından, toplama paneli sekmesinden uygun numune dosyasını seçin ve kaydet'e tıklayın"Çalıştırma tamamlandıktan sonra, numune tüpü kaldırıcıyı kültür tüpü ile elle indirin. Bir durulama adımı başlatmak, akışkan sistemi yıkamak ve her biyolojik replikasyon numunesi arasındaki taşımayı en aza indirmek için.
Aşağıdaki örneğe gitmek için, kayıt simgesinin altındaki örnek tüp adının yanındaki sağ ok simgesini tıklatarak bir sonraki örnek dosyayı seçin. Boya ile hücrelerin floresansını ölçmek için, hücrelerle birlikte bir X P B S içine 1.4 mikrolitre konsantre boya stoğu ekleyin, 50 mikromolar D F H B I bir T.Kültür tüpü kapağını sabitleyin ve çözeltiyi eşit şekilde karıştırmak için üç ila beş kez ters çevirin. Ardından, kapağı çıkarın ve kültür tüpünü numune tüp kaldırıcıya yerleştirin.
Tutucuyu numune enjeksiyon iğnesine kaldırdıktan sonra, uygun numune dosyasının altındaki "kayıt" simgesine tıklayın. Daha sonra, başlat tuşuna basarak bir zamanlayıcıya başlayın"Florojenik aptamers ıspanak iki ve brokolinin in vitro kinetiği, D F H B I boyasına bağlanmak için iki fazlı ilişki kinetiği gösterdi. Her iki aptamer için de kinetik veriler, uzun ölçüm zamanlarında bir fazdan ziyade iki fazlı ilişki ile daha iyi bir şekilde yerleştirildi.
En uygun eğri, hızlı ve yavaş ilişkilendirmeler için hız sabitlerini ve yarı ömür değerlerini belirledi. Ispanak iki bağlanma yetkinlik durumunda, brokoliden daha hızlı açılma gösterdi. Her iki aptamer için ikinci faz kinetiği benzerdir ve ortak bir hız sınırlama adımına karşılık gelebilir.
Aptamers kinetik eğrileri, benzer derecede hızlı ilişkili RNA'lardan oluşur. Ispanak iki T RNA eksprese eden hücreler için, ortalama floresan yoğunluğu veya M F I sıfır zaman noktasında hemen artar. Ayrıca, hücresel floresan beş dakika içinde maksimum dengelenmiş M F I değerine ulaştı.
Buna karşılık, kontrol hücreleri düşük arka plan floresansı gösterdi ve D M S O ilavesiyle M F I değerlerinde değişiklik olmadı Sunulan yöntemler, araştırmacıların florojenik aptamerlerde RNA tabanlı sensörleri nasıl daha hızlı yapabileceklerini belirlemelerini sağlar.
