시험관 내 및 세포 불소 생성 압타머 동역학을 연구하면 사용자는 압타머 염료 상호 작용이 관심 프로세스를 실시간으로 연구할 만큼 충분히 빠른지 평가할 수 있습니다. 제시된 기술은 세포 내부와 외부 모두에서 정량적 동역학 측정을 허용하며, 둘 중 하나는 압타머의 적용에 따라 관련될 수 있습니다. 제시된 방법은 대체 압타머 및 소분자용 RNA 기반 바이오센서를 포함한 모든 형광 RNA 시스템에 적용할 수 있습니다.
시작하려면 열 순환기에서 RNA 재생 프로그램을 설정하십시오. 새 프로그램 만들기"새 단계 추가"를 선택하여 프로그램 만들기"새 단계 추가"를 여러 번 눌러 저장"을 누르기 전에 온도별 단계를 추가합니다."프로그램에 따라 추가 설정을 조정합니다. 시금치 2개와 브로콜리 RNA를 재활성화하려면 0.5밀리리터의 얇은 벽 PCR 튜브에 이중 증류수에 각 RNA의 마이크로몰 줄기 2개를 준비합니다.
그런 다음 동일한 부피의 2-x 재생 버퍼를 추가하여 하나의 마이크로 몰 RNA 용액을 만듭니다. 튜브를 열순환기에 넣습니다. 저장된 재생 프로그램을 열고 실행을 누르십시오"다음으로 플레이트 리더 인젝터 프로그램을 설정하십시오.
형광판 판독기에서 온도를 선택하십시오"섭씨 37도로 설정합니다. 역학을 시작하기 전에 온도가 이 값과 평형을 이루는지 확인하십시오. 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니다.
설정 선택"그런 다음 획득 보기"운동 측정을 위한 프로그램을 입력하려면 루프를 선택하십시오"각 웰에 대해. 다음으로, 기준 설정을 60 기준 읽기로 설정하고 10마이크로리터 주입에 대한 스마트 주입 설정을 설정합니다. 형광 판독 여기 파장을 448 나노 미터로, 방출 파장을 506 나노 미터로, 카트리지를 모노로 설정합니다.
총 읽기 시간을 10분으로 설정하고 읽기 간격은 0.5초입니다. PMT 및 광학 장치를 읽기당 6회 깜박임으로 설정합니다. 그런 다음 다음 웰에 루프를 입력합니다.
플레이트 리더 인젝터를 준비하려면 플레이트 리더에 주입"을 선택하고 지시에 따라 폐기물 수집 플레이트를 공급하십시오. 그런 다음 세척"을 선택하고 플레이트 리더의 지침에 따라 1밀리리터 부피의 이중 증류수, 75% 에탄올 및 증류수로 주입 튜브를 청소합니다. 다음으로 흡인 선택"인젝터가 과도한 액체를 배출 할 수 있도록합니다.
그런 다음 프라임"을 선택하여 2개의 260마이크로리터의 100마이크로몰 D F H B 2개의 인젝터를 프라이밍 I.To 하나의 동역학 실험을 수행합니다. 80마이크로리터의 결합 버퍼 마스터 믹스를 96웰 투명 바닥 판의 한 웰에 추가합니다. 그런 다음 10 마이크로 리터의 변성 RNA를 추가하십시오. 플레이트와 D F H B I 용액을 인젝터에서 섭씨 37도까지 15분 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다.
그런 다음 읽기 영역 아래의 소프트웨어 설정에서 분석할 웰을 선택합니다. 그런 다음 홈 탭에서 실행"을 선택하여 앞에서 설명한 동역학 프로그램을 실행합니다. 모든 실험이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다.
실행 후, 인젝터를 세척하여 이전에 설명된 바와 같이 주입 튜브로부터 나머지 DF H B I 용액을 제거한다. 실험 파일을 설정하려면 유세포 분석기와 컴퓨터를 켜십시오. 실험 탐색기 탭에서 유세포분석기"사용자 이름"을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 새 파일을 만듭니다.
그런 다음 새 실험"드롭다운 창에서 컴퓨터 화면의 새 창이 나타나면 실험 유형을 튜브로 선택하십시오."그런 다음 확인"새 실험 파일에서 그룹 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 샘플 튜브 추가"각 특정 시점에 대해 샘플 튜브에 레이블을 지정하고 샘플을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 복제"를 선택하고 이름 바꾸기"드롭다운 메뉴에서. 다음으로, 배양 튜브의 AI 배지에 1.5 밀리리터의 1 X P B S와 3 마이크로 리터의 유도 세포를 첨가하여 희석 된 세포 용액을 준비합니다. 염료를 첨가하기 전에, 세포의 배경 형광을 측정하여 시간 경과에 따른 폴드 턴을 관찰한다.
염료가 첨가되면 PBS의 세포가 포함된 배양 튜브를 샘플 튜브 리프터에 넣고 리프터를 샘플 주입 바늘로 올립니다. 그런 다음 컬렉션 패널 탭에서 적절한 샘플 파일을 선택하고 기록을 클릭하십시오"실행이 완료되면 배양 튜브로 샘플 튜브 리프터를 손으로 내립니다. 헹굼 단계를 개시하여, 유체계를 세척하고, 각각의 생물학적 복제 샘플 사이의 캐리오버를 최소화한다.
다음 샘플로 이동하려면 레코드 아이콘 아래의 샘플 튜브 이름 근처에 있는 오른쪽 화살표 아이콘을 클릭하여 다음 샘플 파일을 선택합니다. 염료로 세포의 형광을 측정하기 위해 1.4 마이크로리터의 농축 염료 스톡을 세포가 있는 하나의 X P B S에 첨가하고, 최종 농도 50 마이크로몰 DF H I ONE T.Secure 배양 튜브 뚜껑을 고정하고 3 내지 5배 뒤집어 용액을 고르게 혼합한다. 다음으로 뚜껑을 제거하고 배양 튜브를 샘플 튜브 리프터에 넣습니다.
홀더를 샘플 주입 바늘에 올린 후 적절한 샘플 파일 아래의 "레코드"아이콘을 클릭하십시오. 이어서, 타이머 시작 "불소 압타머 시금치 2 및 브로콜리의 시험관내 동역학"을 눌러 시작하여, DF HB I 염료에 결합하는 2상 연관 동역학을 표시하였다. 두 압타머 모두, 동역학 데이터는 긴 측정 시간에서 1상보다 2상 연관성에 의해 더 적합했습니다.
최적 적합 곡선은 빠른 연관성과 느린 연관성에 대한 속도 상수와 반감기 값을 결정했습니다. 결합 능력 상태에서 시금치 2는 브로콜리보다 빠른 턴온을 보였다. 두 압타머에 대한 제2 단계 동역학은 유사하고, 공통된 속도 제한 단계에 대응할 수 있다.
앱타머 운동 곡선은 유사한 정도의 빠른 결합 RNA로 구성됩니다. 시금치 2개의 T RNA를 발현하는 세포의 경우, 평균 형광 강도 또는 MFI는 제로 시점에서 즉시 증가한다. 더욱이, 세포 형광은 5분 이내에 최대 평형 MFI 값에 도달하였다.
대조적으로, 대조군 세포는 낮은 배경 형광을 보였고 DM O 첨가로 MFI 값의 변화가 없었습니다. 제시된 방법을 통해 연구자들은 형광 생성 압타머에서 RNA 기반 센서를 더 빠르게 만들 수있는 방법을 결정할 수 있습니다.
