非整倍性是人类早期流产的主要遗传原因。染色体分离的大多数错误发生在卵母细胞减数分裂期间。因此，评估卵母细胞中的纺锤体组装检查点对于理解卵母细胞容易出错的原因至关重要。
在这里，我们描述了三种技术，通过使用实时成像和免疫荧光的组合在检查点检查不同的关键步骤来全面评估小鼠卵母细胞中的SAC完整性。演示该程序的将是我实验室的研究助理Cecilia Blengini博士。开始制备一毫升含有诺考达唑的培养基，并用DMSO作为对照进行逆转，如手稿中所述。
对于卵母细胞成熟和实时成像，在培养箱中使用预热的96孔板。并分别用150微升对照DMSO，诺考达唑和诺考达唑加逆转处理加载第一，第二和第三孔。同时在手稿中描述的条件下将板保持在培养箱中。
为了开始肌细胞成熟，通过6滴含有DMSO的100微升米力农游离培养基依次转移卵母细胞来去除米力农。并将它们放入96孔板的相应孔中。使用手动或口腔操作的移液器，同时在体视显微镜下观察卵母细胞。
使用配备培养室的明场显微镜对卵母细胞进行成像，培养箱室在37摄氏度，5%二氧化碳和80%湿度的受控环境中。以20分钟的间隔在卵母细胞的中间平面捕获图像，持续24小时。在通过鉴定通过不对称细胞因子的细胞来量化挤出极性体的卵母细胞数量后，卵子旁边和共享透明带内有一个小细胞。
使用成像软件查看图像。微注射前第一阶段被捕的卵母细胞，每微升先前制备的司库林-gfp cRNA 100 纳克。显微注射后，让卵母细胞在二氧化碳培养箱中恢复并翻译RNA至少三个小时。
然后加载150微升培养基，有或没有5微摩尔诺考达唑。和150微升培养基，在96孔板的三个不同孔中加入0.5微摩尔的逆转。通过六滴米力农游离培养基洗涤显微注射的卵母细胞，并将三分之一的卵母细胞转移到每次治疗中。
将培养箱中的板保持在37摄氏度，5%二氧化碳和80%湿度，直到卵母细胞恢复减数分裂，米力农洗涤后约三小时。使用配备培养箱的荧光显微镜记录卵母细胞成熟的图像。使用图像分析软件量化 securin-gfp 破坏并打开 GFP 通道的图像，从时间 0.1 开始。
在首选的分析软件中，使用选择或形状工具标记每个卵母细胞并为每个细胞生成感兴趣的区域。使用相同的感兴趣区域选择要稍后减去的背景区域，并在所有时间点测量每个感兴趣区域中的GFP像素强度。最后，对于每个GFP值，减去背景中感兴趣区域的测量值。
减数分裂分成三组后，将每组减数分裂转移到100微升米力农游离培养基中。用矿物油覆盖液滴，并将它们放入培养箱中三、五和七个小时，分别达到早期前期一期、晚期前期一期和中期一期。在指定的时间点，使用九孔玻璃培养皿在室温下将卵母细胞转移到PME缓冲液中的500微升滴剂中2%多聚甲醛中20分钟，以固定卵母细胞。
然后将细胞转移到含有500微升封闭溶液的干净孔中。为了继续MAD2检测，将卵母细胞转移到含有500微升透化溶液液滴的干净孔中。在室温下孵育20分钟后，将细胞转移到封闭溶液的新孔中并孵育10分钟。
将卵母细胞转移到含有抗MAD2抗体和抗着丝粒抗体的30微升封闭溶液中，并在室温下孵育两小时。为了在将细胞转移到补充有0.5%Triton的30微升PME缓冲液后洗涤多余的一抗，在加湿室中孵育10分钟。将细胞转移到含有抗人633和抗兔568等二抗的30微升封闭溶液中。
并在室温下孵育一小时。要将细胞安装在显微镜载玻片上，请将细胞转移到含有DAPI的10微升封片剂中。在盖玻片的每个角添加小点凡士林。
小心地将它们放在安装介质滴的顶部，然后缓慢按压以分发。使用透明指甲油将盖玻片密封在载玻片上。使用配备40或63 X物镜的共聚焦显微镜对动影进行成像。
并使用抗着丝粒抗体信号确定Z范围，从而可以对整个染色体区域进行成像。DMSO处理的对照卵母细胞在米力农释放后约14小时挤出极性体。SAC活化后，诺考达唑处理的卵母细胞在中期一中被阻止，并且没有挤出极性体。
然而，在没有SAC激活的情况下，尽管没有动粒微管附着，卵母细胞挤出极性体。评估了肌成熟过程中的Securin-gfp降解速率。其中对照DMSO处理的卵母细胞在米力农洗脱后约10小时开始降低。
当卵母细胞在SAC活化剂诺考达唑存在下成熟时，在整个肌成熟期间，司库林-GFP水平稳定。相反，当用逆转治疗阻止SAC活化时，司库林-GFP模式加速，并且在米力农洗脱后约4小时开始降解，符合SAC抑制。采用共聚焦成像检测成熟至早期前期一期、晚期期一期和中期一期的卵母细胞着丝粒和MAD2。
为了评估SAC信号的强度，对定位的动粒，量化MAD2像素强度。在早期中期，当大多数动粒未附着在微管上时，运动粒的MAD2募集水平显着。MAD2的水平在后期中期降低，并且在中期一时几乎不存在，此时所有动粒都稳定地附着在微管上。
重要的是要强调，这些技术中的每一种都有其局限性和解释。我们建议结合使用这些方法来评估 SAC 完整性。这三篇文章使研究人员能够评估卵母细胞中囊的严格程度，从而深入了解人类卵子中非整倍性的潜在原因。
