이배체는 인간의 조기 유산의 주요 유전 적 원인입니다. 염색체 분리의 대부분의 오류는 난 모세포에서 감수 분열 중에 발생합니다. 따라서 난모세포에서 스핀들 어셈블리 체크포인트를 평가하는 것은 난모세포에 오류가 발생하기 쉬운 이유를 이해하는 데 중요합니다.
여기에서는 라이브 이미징과 면역 형광의 조합을 사용하여 체크 포인트에서 서로 다른 중요한 단계를 검사하여 마우스 난 모세포의 SAC 무결성을 종합적으로 평가하는 세 가지 기술을 설명합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구원 인 Cecilia Blengini 박사가 될 것입니다. 시작하려면 원고에 기재된 바와 같이 대조군으로서 DMSO와 함께 노코다졸 및 리버신을 함유하는 배양 배지 1밀리리터를 준비한다.
난 모세포 성숙 및 라이브 이미징을 위해 인큐베이터에서 예열 된 96 웰 플레이트를 사용하십시오. 제1, 제2 및 제3 웰에 각각 150 마이크로리터의 대조군 DMSO, 노코다졸 및 노코다졸 플러스 리버신 처리를 로딩하였다. 원고에 설명 된 조건 하에서 인큐베이터에 플레이트를 보관하면서.
근염 성숙을 시작하려면 DMSO를 함유 한 100 마이크로 리터의 밀리 논 유리 배양 배지 6 방울을 통해 난 모세포를 순차적으로 옮겨 밀리 논을 제거하십시오. 그리고 그것들을 96웰 플레이트의 해당 우물에 넣습니다. 손 또는 입으로 작동되는 피펫을 사용하여 실체 현미경으로 난모세포를 관찰합니다.
섭씨 37도, 5%이산화탄소 및 80%습도에서 통제된 환경의 인큐베이터 챔버가 장착된 명시야 현미경을 사용하여 난모세포를 이미지화합니다. 난 모세포의 중간 평면에서 24 시간 동안 20 분 간격으로 이미지를 캡처합니다. 극성체를 압출하는 난자의 수를 정량화한 후 비대칭 사이토카인을 통과하는 세포를 계란 옆과 공유 구역 내에서 펠루시다 내에서 작은 세포로 식별합니다.
이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 봅니다. 이전에 준비된 securin-gfp cRNA의 마이크로리터당 100나노그램으로 프로페이즈 1 체포된 난모세포를 마이크로주입합니다. 미세 주입 후, 난 모세포가 적어도 3 시간 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 RNA를 회수하고 번역하도록합니다.
그런 다음 5 마이크로 몰의 노코 다졸을 포함하거나 포함하지 않고 150 마이크로 리터의 배양 배지를로드하십시오. 및 96-웰 플레이트의 3개의 상이한 웰에 0.5 마이크로몰의 리버신을 갖는 150 마이크로리터의 배양 배지를 포함한다. 미세 주입 된 난 모세포를 6 방울의 밀리 논 프리 배양 배지로 세척하고 난 모세포의 1/3을 각 처리로 옮깁니다.
접시를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소, 80% 습도로 유지하여 난모세포가 감수 분열을 재개할 때까지 밀리논 세척 후 약 3시간 후에 플레이트를 유지합니다. 인큐베이터 챔버가 장착된 형광 현미경을 사용하여 난모세포 성숙의 이미지를 기록합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 securin-gfp 파괴를 정량화하고 시간 0.1부터 GFP 채널의 이미지를 엽니다.
선호하는 분석 소프트웨어에서 선택 또는 모양 도구를 사용하여 각 난 모세포를 표시하고 각 세포에 대한 관심 영역을 생성하십시오. 동일한 관심 영역을 사용하여 나중에 뺄 배경 영역을 선택하고 모든 시점에서 각 관심 영역의 GFP 픽셀 강도를 측정합니다. 마지막으로 각 GFP 값에서 배경에서 관심 영역의 측정값을 뺍니다.
감수 분열을 3 개의 그룹으로 나눈 후, 감수 분열의 각 그룹을 밀리 논이없는 배양 배지 100 마이크로 리터 방울로 옮깁니다. 방울을 미네랄 오일로 덮고 3 시간, 5 시간 및 7 시간 동안 인큐베이터에 넣어 각각 초기 중기 1, 후기 중기 1 단계 및 중기 1 단계에 도달합니다. 지정된 시점에서, 9웰 유리 접시를 사용하여 실온에서 20분 동안 PME 완충액의 2% 파라포름알데히드 500마이크로리터 방울로 옮겨 난모세포를 고정시킨다.
그런 다음 세포를 500 마이크로 리터의 블로킹 용액이 들어있는 깨끗한 우물로 옮깁니다. MAD2 검출을 계속하려면 난모세포를 500마이크로리터의 투과화 용액 방울이 들어 있는 깨끗한 웰로 옮깁니다. 실온에서 20분 동안 배양한 후, 세포를 블로킹 용액의 새로운 웰로 옮기고 10분 동안 배양한다.
난모세포를 항-MAD2 항체 및 항중심체 항체와 함께 30 마이크로리터 방울의 블로킹 용액으로 옮기고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 세포를 0.5% 트리톤이 보충된 PME 완충액 30 마이크로리터 방울로 옮긴 후 과량의 1차 항체를 세척하기 위해, 가습된 챔버에서 10분 동안 배양한다. 세포를 항-인간 633 및 항-토끼 568과 같은 2차 항체를 함유하는 블로킹 용액의 30 마이크로리터 방울로 옮긴다.
그리고 실온에서 1시간 동안 배양한다. 현미경 슬라이드에 세포를 장착하려면 DAPI가 포함된 10마이크로리터의 장착 배지에 세포를 옮깁니다. 커버 슬립의 각 모서리에 작은 석유 젤리 점을 추가하십시오.
장착 미디어 드롭 위에 조심스럽게 놓고 천천히 눌러 분배합니다. 투명 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 슬라이드에 밀봉합니다. 40 또는 63 X 대물렌즈가 장착된 컨포칼 현미경을 사용한 키네토코어 이미지.
항중심체 항체 신호를 이용하여 전체 염색체 영역의 영상화를 가능하게 하는 Z 범위를 결정한다. DMSO 처리된 대조군 난모세포는 밀리논으로부터 방출된 후 약 14시간 후에 극성체를 압출하였다. SAC 활성화 후, 노코다졸 처리된 난모세포는 중기 1에서 체포되었고 극성체를 압출하지 않았다.
그러나, SAC 활성화가없는 경우, 난 모세포는 키네 토코 레 미세 소관 부착물이 없음에도 불구하고 극성체를 압출했다. 근막 성숙 동안 securin-gfp 분해 속도를 평가하였다. 대조군 DMSO 처리된 난모세포는 세큐린-gfp 강도가 밀리논 세척 후 대략 10시간에서 감소하기 시작한다.
난 모세포가 SAC 활성화제 인 노코다졸의 존재하에 성숙되었을 때, securin-gfp 수준은 근막 성숙의 전체 기간 동안 안정했다. 대조적으로, 역전 처리로 SAC 활성화를 방지하는 경우 securin-gfp 패턴이 가속화되고 SAC 억제와 일치하는 밀리논 세척 후 약 4시간에서 분해가 시작되었습니다. 컨포칼 이미징은 초기 전구 중기 1, 후기 중기 1기 및 중기 1기로 성숙된 난모세포의 중심체 및 MAD2를 검출하는 데 사용되었습니다.
SAC 신호의 세기를 평가하기 위해, 키네토코어화된 키네토코어드, MAD2 픽셀 강도를 정량화하였다. 키네토코어에 대한 상당한 수준의 MAD2 동원은 대부분의 키네토코어가 미세소관에 부착되지 않은 초기 중기 1단계에서 발생합니다. MAD2의 수준은 후기 중기에서 감소했으며 모든 키네토코어가 미세소관에 안정적으로 부착되었을 때 중기 1에서는 거의 없었습니다.
이러한 각 기술에는 한계와 해석이 있다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 또한 이러한 방법의 조합을 수행하여 SAC 무결성을 평가하는 것이 좋습니다. 이 세 가지 에세이를 통해 연구자들은 난모세포에서 주머니의 엄격성을 평가하여 인간 난자에서 이수성의 잠재적 원인에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
