Анеуплоидия является ведущей генетической причиной раннего выкидыша у людей. Большинство ошибок в сегрегации хромосом происходит во время мейоза в ооцитах. Поэтому оценка контрольной точки сборки веретена в ооцитах имеет решающее значение для понимания того, почему ооциты подвержены ошибкам.
Здесь мы описываем три метода всесторонней оценки целостности SAC в ооцитах мыши путем изучения различных критических этапов на контрольной точке с использованием комбинации живой визуализации и иммунофлуоресценции. Продемонстрировать процедуру будет доктор Сесилия Бленгини, научный сотрудник из моей лаборатории. Для начала получают один миллилитр культуральной среды, содержащей нокодазол и реверсин, с ДМСО в качестве контрольной, как описано в рукописи.
Для созревания яйцеклеток и визуализации в реальном времени используют предварительно нагретую 96-луночную пластину в инкубаторе. И нагрузите первую, вторую и третью скважину 150 микролитрами контрольного ДМСО, нокодазола и нокодазола плюс реверсиновой обработкой соответственно. При этом хранят пластину в инкубаторе в условиях, описанных в рукописи.
Чтобы начать миотическое созревание, удаляют мильринон путем последовательного переноса ооцитов через 6 капель 100 микролитров свободной от милринона культуральной среды, содержащей ДМСО. И поместите их в соответствующий колодец 96-луночной плиты. Использование пипетки с ручным или ротовым управлением при просмотре ооцитов под стереомикроскопом.
Визуализируйте ооциты с помощью ярко-полевого микроскопа, оснащенного камерой инкубатора с контролируемой средой при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа и влажности 80%. Захват изображений в средней плоскости ооцитов с интервалом 20 минут в течение 24 часов. После количественной оценки количества ооцитов, которые выдавливают полярное тело, путем идентификации клеток, которые проходят через асимметричные цитокины с маленькой клеткой рядом с яйцеклеткой и в общей зоне пеллюцида.
Просматривайте изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений. Микроинъективная профаза один арестованных ооцитов со 100 нанограммами на микролитры ранее приготовленной секурин-гфп цРНК. После микроинъекции дайте яйцеклеткам восстановиться и перевести РНК в инкубатор углекислого газа в течение не менее трех часов.
Затем загрузите 150 микролитров питательной среды с пятью микромолярами нокодазола или без них. И 150 микролитров культуральной среды с 0,5 микромоляром реверсина в трех разных скважинах 96-луночной пластины. Промывайте микроинъекционные ооциты через шесть капель свободной от милринона культуральной среды и переносите одну треть ооцитов в каждую обработку.
Держите пластину в инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% углекислого газа и 80% влажности, пока ооциты не возобновятся мейозом, примерно через три часа после промывания мильринона. Записывайте изображения созревания ооцитов с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой инкубатора. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки разрушения securin-gfp и открытия изображений канала GFP, начиная с момента 0.1.
В предпочтительном аналитическом программном обеспечении используйте инструмент выделения или формы, чтобы отметить каждую яйцеклетку и создать область, представляющую интерес для каждой клетки. Используйте ту же область интереса, чтобы выбрать фоновую область, которая будет вычтена позже, и измерить интенсивность пикселей GFP в каждой интересующей области во всех точках времени. Наконец, из каждого значения GFP вычтите измерение интересующей области в фоновом режиме.
После разделения мейоза на три группы переносят каждую группу мейоза на 100 микролитровых капель свободной от милринона культуральной среды. Залейте капли минеральным маслом и поместите их в инкубатор на три, пять и семь часов, чтобы достичь ранней прометафазы, поздней прометафазы и метафазы одной стадии соответственно. В назначенные моменты времени зафиксируйте ооциты, перенеся их в 500 микролитров капель 2%-го параформальдегида в буфер ПМЭ в течение 20 минут при комнатной температуре с помощью стеклянной посуды с девятью лунками.
Затем переложите клетки в чистый колодец, содержащий 500 микролитр капли блокирующего раствора. Чтобы продолжить обнаружение MAD2, перенесите ооциты в чистую лунку, содержащую 500-микролитровую каплю раствора для пермеабилизации. После инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре переложить клетки в новый лунку блокирующего раствора и инкубировать в течение 10 минут.
Переведите ооциты в 30-микролитровую каплю блокирующего раствора с антителами анти-MAD2 и антицентромерными антителами и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре. Для промывания избытка первичных антител после переноса клеток на 30 микролитров капли буфера ПМЭ, дополненного 0,5%-тритоном, инкубируют в течение 10 минут в увлажненной камере. Переместите клетки в 30 микролитр капли блокирующего раствора, содержащего вторичные антитела, такие как античеловеческий 633 и анти-кролик 568.
И инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре. Чтобы установить клетки на предметное стекло микроскопа, перенесите клетки на 10-микролитровую каплю монтажного носителя, содержащего DAPI. Добавьте небольшие точки вазелина в каждый угол крышки.
Осторожно поместите их поверх монтажного носителя и медленно нажмите, чтобы распределить. Запечатайте крышку на слайде прозрачным лаком для ногтей. Изображение кинетохоров с помощью конфокального микроскопа, оснащенного объективом 40 или 63 X.
А с помощью сигнала антицентромерных антител определяют Z-диапазон, который позволяет визуализировать всю область хромосомы. Обработанные DMSO контрольные ооциты экструдировали полярное тело примерно через 14 часов после высвобождения из милринона. После активации SAC обработанные нокодазолом ооциты были арестованы в метафазном виде и не экструдировали полярное тело.
Однако в отсутствие активации SAC ооциты экструдировали полярное тело, несмотря на отсутствие прикреплений кинетохорных микротрубочек. Оценивали скорость деградации секурин-gfp во время миотического созревания. При этом контрольная интенсивность ДМСО, обработанных ооцитами секурина-gfp, начинает снижаться примерно через 10 часов после вымывания милринона.
Когда ооциты созревали в присутствии активирующего агента SAC, уровни нокодазола, секурина-gfp были стабильными в течение всего периода миотического созревания. Напротив, при предотвращении активации SAC с помощью реверсинной обработки картина securin-gfp ускорялась, и деградация начиналась примерно через четыре часа после вымывания милринона в соответствии с ингибированием SAC. Конфокальная визуализация использовалась для обнаружения центромер и MAD2 ооцитов, созревших до ранней прометафазы, поздней прометафазы и метафазной.
Чтобы оценить силу сигнала SAC, кинетохора локализовалась, интенсивность пикселей MAD2 была количественно определена. Значительные уровни рекрутирования MAD2 к кинетохорам наблюдаются в начале прометафазы, когда большинство кинетохоров не были прикреплены к микротрубочкам. Уровни MAD2 снижались в более поздних прометафазах и почти отсутствовали на метафазе, когда все кинетохоры были стабильно прикреплены к микротрубочкам.
Важно подчеркнуть, что каждый из этих методов имеет свои ограничения и свою интерпретацию. И мы предлагаем выполнить комбинацию этих методов для оценки целостности SAC. Эти три эссе позволяют исследователям оценить строгость мешка в ооцитах, давая представление о потенциальной причине анеуплоидии в человеческих яйцеклетках.
