Anöploidi, insanlarda erken düşüklerin önde gelen genetik nedenidir. Kromozom ayrışmasındaki hataların çoğu oositlerde mayoz sırasında meydana gelir. Bu nedenle, oositlerde iğ montaj kontrol noktasının değerlendirilmesi, oositlerin neden hataya açık olduğunu anlamak için kritik öneme sahiptir.
Burada, canlı görüntüleme ve immünofloresan kombinasyonunu kullanarak kontrol noktasındaki farklı kritik adımları inceleyerek fare oositlerinde SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için üç teknik açıklanmaktadır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Dr. Cecilia Blengini olacak. Nokodazol içeren bir mililitre kültür medyası hazırlamaya başlamak ve DMSO ile makalede açıklandığı gibi bir kontrol olarak tersine çevirmek.
Yumurta olgunlaşması ve canlı görüntüleme için bir inkübatörde önceden ısıtılmış 96 delikli bir plaka kullanın. Birinci, ikinci ve üçüncü kuyuyu sırasıyla 150 mikrolitre kontrol DMSO, nokodazol ve nokodazol artı reversin tedavisi ile yükleyin. Plakayı inkübatörde el yazmasında açıklanan koşullar altında tutarken.
Miyotik olgunlaşmayı başlatmak için, oositleri DMSO içeren 6 damla 100 mikrolitre milrinon serbest kültür ortamından sırayla aktararak milrinonu çıkarın. Ve bunları 96 kuyucuklu plakanın karşılık gelen kuyusuna yerleştirin. Yumurtaları stereo mikroskop altında görüntülerken elle veya ağızla çalışan pipet kullanmak.
Oositleri, 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksit ve% 80 nemde kontrollü bir ortama sahip bir inkübatör odası ile donatılmış parlak alan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Oositlerin orta düzleminde 24 saat boyunca 20 dakikalık aralıklarla görüntü yakalayın. Asimetrik sitokinlerden geçen hücreleri yumurtanın yanında ve paylaşılan zona pellucida içinde küçük bir hücre ile tanımlayarak kutupsal bir cismi ekstrüzyon yapan oositlerin sayısını ölçtükten sonra.
Görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleri görüntüleyin. Önceden hazırlanmış sekürin-gfp cRNA'nın mikrolitresi başına 100 nanogram ile pro-faz bir tutuklanmış oositleri mikroenjekte edin. Mikroenjeksiyondan sonra, oositlerin karbondioksit inkübatöründe RNA'yı en az üç saat boyunca geri kazanmasına ve çevirmesine izin verin.
Daha sonra beş mikromolar nokodazol içeren veya içermeyen 150 mikrolitre kültür ortamı yükleyin. Ve 96 delikli bir plakanın üç farklı kuyusunda 0,5 mikromolar ters yönde 150 mikrolitre kültür ortamı. Mikroenjekte edilen oositleri altı damla milrinon içermeyen kültür ortamından yıkayın ve yumurtaların üçte birini her tedaviye aktarın.
Plakayı inkübatörde, milrinon yıkamasından yaklaşık üç saat sonra, oositler mayoza devam edene kadar% 5 karbondioksit ve% 80 nem ile 37 santigrat derecede tutun. Bir inkübatör odası ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak oosit olgunlaşmasının görüntülerini kaydedin. Securin-gfp tahribatını ölçmek ve GFP kanalının görüntülerini 0.1 saatinden başlayarak açmak için görüntü analiz yazılımını kullanın.
Tercih edilen analiz yazılımında, her bir oositi işaretlemek ve her hücre için bir ilgi alanı oluşturmak için seçim veya şekil aracını kullanın. Daha sonra çıkarılacak bir arka plan alanı seçmek için aynı ilgi alanını kullanın ve her bir ilgi alanındaki GFP piksel yoğunluğunu tüm zaman noktalarında ölçün. Son olarak, her GFP değerine, arka planda ilgilenilen bölgenin ölçümünü çıkarın.
Mayozu üç gruba ayırdıktan sonra, her mayoz grubunu 100 mikrolitre damla milrinon içermeyen kültür ortamına aktarın. Damlaları mineral yağ ile örtün ve sırasıyla erken prometafaz bir, geç prometafaz bir ve metafaz bir aşamaya ulaşmak için üç, beş ve yedi saat boyunca inkübatöre yerleştirin. Belirlenen zaman noktalarında, oositleri, dokuz kuyucuklu bir cam tabak kullanarak oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PME tamponunda% 2 paraformaldehit 500 mikrolitre damlasına aktararak sabitleyin.
Daha sonra hücreleri 500 mikrolitrelik bir damla bloke çözeltisi içeren temiz bir kuyuya aktarın. MAD2 tespitine devam etmek için, yumurtaları 500 mikrolitrelik bir damla geçirgenlik çözeltisi içeren temiz bir kuyuya aktarın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ettikten sonra, hücreleri yeni bir bloke çözeltisi kuyucuğuna aktarın ve 10 dakika boyunca inkübe edin.
Oositleri anti-MAD2 antikoru ve anti-sentromer antikoru ile 30 mikrolitrelik bir blokaj çözeltisine aktarın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Hücreleri 30 mikrolitreye aktardıktan sonra fazla primer antikorları yıkamak için,% 0.5 Triton ile desteklenmiş PME tamponunun damlası, nemlendirilmiş odada 10 dakika inkübe edin. Hücreleri, anti-insan 633 ve anti-tavşan 568 gibi ikincil antikorlar içeren 30 mikrolitrelik bir bloke çözeltisi damlasına aktarın.
Ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Hücreleri mikroskop slaydına monte etmek için, hücreleri DAPI içeren 10 mikrolitrelik bir montaj ortamı damlasına aktarın. Kapak kaymasının her köşesine küçük petrol jölesi noktaları ekleyin.
Bunları dikkatlice montaj ortamı damlasının üzerine yerleştirin ve dağıtmak için yavaşça basın. Kapak kaymasını şeffaf oje kullanarak slayda kapatın. 40 veya 63 X objektif ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak görüntü kinetochores.
Ve anti-sentromer antikor sinyalini kullanarak, tüm kromozom alanının görüntülenmesini sağlayan Z aralığını belirler. DMSO ile tedavi edilen kontrol oositleri, milrinondan salındıktan yaklaşık 14 saat sonra polar bir cismi ekstrüde etti. SAC aktivasyonundan sonra, nokodazol ile tedavi edilen oositler metafaz birde tutuklandı ve bir polar cisim ekstrüzyon yapmadı.
Bununla birlikte, SAC aktivasyonunun yokluğunda, oositler kinetochore mikrotübül ekleri olmamasına rağmen polar bir cismi ekstrüde ettiler. Miyotik matürasyon sırasında sekürin-gfp yıkım hızı değerlendirildi. Burada DMSO ile tedavi edilen kontrol oositleri sekürin-gfp yoğunluğu, milrinon yıkamasından yaklaşık 10 saat sonra azalmaya başlar.
Oositler SAC aktive edici ajan varlığında olgunlaştığında, nokodazol, sekürin-gfp düzeyleri tüm miyotik olgunlaşma periyodu boyunca stabildi. Buna karşılık, reversin tedavisi ile SAC aktivasyonunu önlerken, sekürin-gfp paterni hızlandı ve SAC inhibisyonu ile tutarlı milrinon yıkamasından yaklaşık dört saat sonra bozulma başladı. Konfokal görüntüleme, erken prometafaz bir, geç prometafaz bir ve metafaz bire olgunlaşan oositlerin sentromerleri ve MAD2'sini saptamak için kullanıldı.
SAC sinyalinin gücünü değerlendirmek için, kinetochore lokalize edildi, MAD2 piksel yoğunluğu ölçüldü. Kinetochores'e MAD2 alımının önemli seviyeleri, çoğu kinetochor'un mikrotübüllere bağlanmadığı erken prometafaz birinde ortaya çıkar. MAD2 seviyeleri daha sonraki prometafazda azaldı ve tüm kinetochores mikrotübüllere kararlı bir şekilde bağlandığında metafaz birde neredeyse yoktu.
Bu tekniklerin her birinin sınırlamaları ve yorumları olduğunu vurgulamak önemlidir. Ve SAC bütünlüğünü değerlendirmek için bu yöntemlerin bir kombinasyonunu gerçekleştirmenizi öneririz. Bu üç makale, araştırmacıların oositlerdeki kesenin sıkılığını değerlendirmelerine ve insan yumurtalarında anöploidinin potansiyel bir nedeni hakkında fikir vermelerine olanak tanır.
