Aneuploidie ist die häufigste genetische Ursache für frühe Fehlgeburten beim Menschen. Die meisten Fehler in der Chromosomentrennung treten während der Meiose in Eizellen auf. Daher ist die Auswertung des Spindelaufbau-Checkpoints in Oozyten entscheidend, um zu verstehen, warum Oozyten fehleranfällig sind.
Hier beschreiben wir drei Techniken, um die SAC-Integrität in Maus-Eizellen umfassend zu bewerten, indem verschiedene kritische Schritte am Checkpoint mit einer Kombination aus Live-Bildgebung und Immunfluoreszenz untersucht werden. Das Verfahren wird von Dr. Cecilia Blengini, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert. Bereiten Sie zunächst einen Milliliter Nährmedien vor, die Nocodazol und Reversin enthalten, mit DMSO als Kontrolle, wie im Manuskript beschrieben.
Für die Eizellreifung und Live-Bildgebung verwenden Sie eine vorgewärmte 96-Well-Platte in einem Inkubator. Und beladen Sie die erste, zweite und dritte Vertiefung mit 150 Mikrolitern der Kontrolle DMSO, Nocodazol und Nocodazol plus Reversin-Behandlung. Während die Platte im Inkubator unter den im Manuskript beschriebenen Bedingungen aufbewahrt wird.
Um die myotische Reifung zu beginnen, entfernen Sie Milrinon, indem Sie die Eizellen nacheinander durch 6 Tropfen von 100 Mikrolitern milrinonfreiem Nährmedien, die DMSO enthalten, übertragen. Und legen Sie sie in die entsprechende Vertiefung der 96-Well-Platte. Verwendung einer hand- oder mundbetriebenen Pipette, während die Eizellen unter einem Stereomikroskop betrachtet werden.
Bilden Sie die Eizellen mit einem Hellfeldmikroskop ab, das mit einer Inkubatorkammer ausgestattet ist, mit einer kontrollierten Umgebung bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 80% Luftfeuchtigkeit. Nehmen Sie Bilder auf der mittleren Ebene der Eizellen in Intervallen von 20 Minuten für 24 Stunden auf. Nach der Quantifizierung der Anzahl der Eizellen, die einen Polkörper extrudieren, durch Identifizierung der Zellen, die asymmetrische Zytokine mit einer kleinen Zelle neben der Eizelle und innerhalb der gemeinsamen Zona pellucida durchlaufen.
Betrachten Sie die Bilder mit einer Imaging-Software. Mikroinjizieren Pro-Phase-eins-verhaftete Eizellen mit 100 Nanogramm pro Mikroliter zuvor hergestellter Securin-gfp-cRNA. Lassen Sie die Eizellen nach der Mikroinjektion mindestens drei Stunden lang die RNA im Kohlendioxid-Inkubator erholen und übersetzen.
Dann laden Sie 150 Mikroliter Nährmedien mit oder ohne fünf Mikromolar Nocodazol. Und 150 Mikroliter Nährmedien mit 0,5 Mikromolar Reversin in drei verschiedenen Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Waschen Sie die mikroinjizierten Eizellen durch sechs Tropfen milrinonfreies Nährmedium und übertragen Sie ein Drittel der Eizellen in jede Behandlung.
Halten Sie die Platte im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 80% Luftfeuchtigkeit, bis die Eizellen die Meiose wieder aufnehmen, etwa drei Stunden nach dem Waschen von Milrinon. Nehmen Sie Bilder der Eizellreifung mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einer Inkubatorkammer ausgestattet ist. Verwenden Sie eine Bildanalysesoftware, um die Securin-GFP-Zerstörung zu quantifizieren, und öffnen Sie die Bilder des GFP-Kanals ab dem Zeitpunkt 0,1.
Verwenden Sie in der bevorzugten Analysesoftware das Auswahl- oder Formwerkzeug, um jede Eizelle zu markieren und eine Region von Interesse für jede Zelle zu generieren. Verwenden Sie denselben Interessenbereich, um einen Hintergrundbereich auszuwählen, der später subtrahiert werden soll, und messen Sie die GFP-Pixelintensität in jedem interessierenden Bereich zu allen Zeitpunkten. Ziehen Sie schließlich zu jedem GFP-Wert die Messung des interessierenden Bereichs im Hintergrund ab.
Nachdem Sie die Meiose in drei Gruppen aufgeteilt haben, übertragen Sie jede Meiosegruppe in 100 Mikroliter Tropfen Milrinon-freie Nährmedien. Decken Sie die Tropfen mit Mineralöl ab und legen Sie sie für drei, fünf und sieben Stunden in den Inkubator, um die frühe Prometaphase eins, die späte Prometaphase eins und die Metaphase eins zu erreichen. Fixieren Sie die Eizellen zu den zugewiesenen Zeitpunkten, indem Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer Glasschale mit neun Vertiefungen in 500 Mikroliter Tropfen 2% Paraformaldehyd in PME-Puffer überführen.
Dann geben Sie die Zellen in eine saubere Vertiefung, die einen 500-Mikroliter-Tropfen Blocklösung enthält. Um den MAD2-Nachweis fortzusetzen, überführen Sie die Eizellen in eine saubere Vertiefung, die einen 500-Mikroliter-Tropfen Permeabilisierungslösung enthält. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei Raumtemperatur werden die Zellen in eine neue Vertiefung mit Blocklösung überführt und 10 Minuten lang inkubiert.
Die Eizellen werden in einen 30-Mikroliter-Tropfen Blocklösung mit Anti-MAD2-Antikörper und Anti-Zentromer-Antikörper überführt und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Um überschüssige primäre Antikörper nach dem Transfer der Zellen auf 30 Mikroliter Tropfen PME-Puffer, ergänzt mit 0,5% Triton, zu waschen, inkubieren Sie für 10 Minuten in der befeuchteten Kammer. Übertragen Sie die Zellen in einen 30-Mikroliter-Tropfen Blocklösung, der sekundäre Antikörper wie Anti-Mensch 633 und Anti-Kaninchen 568 enthält.
Und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Um die Zellen auf dem Objektträger zu montieren, übertragen Sie die Zellen auf einen 10-Mikroliter-Tropfen eines DAPI-haltigen Mount-Mediums. Fügen Sie kleine Punkte Vaseline in jede Ecke des Deckglases hinzu.
Legen Sie sie vorsichtig auf den Behälter des Montagemediums und drücken Sie sie langsam an, um sie zu verteilen. Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack auf dem Objektträger. Bilden Sie Kinetochoren mit einem konfokalen Mikroskop ab, das mit einem 40- oder 63-X-Objektiv ausgestattet ist.
Und mit Hilfe des Anti-Zentromer-Antikörpersignals bestimmen Sie den Z-Bereich, der die Abbildung des gesamten Chromosomenbereichs ermöglicht. Die mit DMSO behandelten Kontroll-Eizellen extrudierten etwa 14 Stunden nach der Freisetzung von Milrinon einen Polkörper. Nach der SAC-Aktivierung wurden mit Nocodazol behandelte Eizellen in der ersten Metaphase blockiert und extrudierten keinen Polkörper.
In Ermangelung einer SAC-Aktivierung extrudierten die Oozyten jedoch einen Polkörper, obwohl sie keine Kinetochor-Mikrotubuli-Anhänge aufwiesen. Die Geschwindigkeit des Securin-GFP-Abbaus während der myotischen Reifung wurde untersucht. Wobei die Securin-GFP-Intensität der mit DMSO behandelten Kontroll-Oozyten etwa 10 Stunden nach dem Auswaschen von Milrinon abnimmt.
Wenn Eizellen in Gegenwart des SAC-Aktivators Nocodazol gereift wurden, waren die Securin-GFP-Spiegel während der gesamten myotischen Reifung stabil. Im Gegensatz dazu beschleunigte sich bei der Verhinderung der SAC-Aktivierung mit einer Reversin-Behandlung das Securin-GFP-Muster und der Abbau begann etwa vier Stunden nach dem Auswaschen von Milrinon, was mit der SAC-Hemmung übereinstimmte. Konfokale Bildgebung wurde verwendet, um Zentromere und MAD2 von Oozyten zu erkennen, die zu früher Prometaphase eins, später Prometaphase eins und Metaphase eins gereift waren.
Um die Stärke des SAC-Signals zu bewerten, wurde die kinetochorlokalisierte MAD2-Pixelintensität quantifiziert. Signifikante Raten der MAD2-Rekrutierung für Kinetochoren treten in der frühen Prometaphase eins auf, wenn die meisten Kinetochoren nicht an Mikrotubuli gebunden waren. Die MAD2-Spiegel reduzierten sich in der späteren Prometaphase und waren in der ersten Metaphase fast nicht vorhanden, als alle Kinetochoren stabil an Mikrotubuli gebunden waren.
Es ist wichtig zu betonen, dass jede dieser Techniken ihre Grenzen und ihre Interpretation hat. Und wir empfehlen, eine Kombination dieser Methoden durchzuführen, um die SAC-Integrität zu bewerten. Diese drei Aufsätze ermöglichen es den Forschern, die Stringenz des Sacks in Eizellen zu bewerten und einen Einblick in eine mögliche Ursache der Aneuploidie in menschlichen Eiern zu geben.
