此处描述的方案提供了一种综合方法，将经典微生物学测定与单细胞活体成像相结合，以表征高氧氟沙星处理后大肠杆菌持久性细胞。该技术的主要优点是在群体和单细胞水平上分析持久性现象。结合群体和单细胞分析可以对持久性表型进行分子和细胞表征。
首先，从LB琼脂平板上的冷冻甘油原液中划线感兴趣的细菌菌株，并在37摄氏度下孵育过夜15至19小时以获得单个菌落。在含有5毫升补充有0.4%葡萄糖的MOPS生长培养基的玻璃管中接种分离的菌落，如果需要，将选择性抗生素添加到培养基中。将试管置于37摄氏度和180rpm的振荡培养箱中过夜。
第二天，将一毫升培养物以2， 300g离心三分钟以沉淀细胞，并用相同体积的PBS轻轻重悬沉淀。测量 600 纳米处的 OD，并计算初始 OD 600 在 2 毫升的最终体积中为 0.01 所需的体积。接下来，将两毫升MOPS甘油0.4%培养基加入透明底部24孔板的孔中，并接种计算的过夜培养体积。
将 24 孔板放入自动酶标仪中以监测 OD 600 24 小时。将酶标仪设置为在 37 摄氏度的温度和 140 rpm 的高轨道旋转下每 15 分钟测量一次 OD 600。融化 100 毫升 LB 琼脂，并将烧瓶储存在 55 摄氏度以避免凝固。
准备六个小玻璃烧瓶，并使用无菌移液管将五毫升液体LB琼脂培养基移入每个烧瓶中。取每毫升5毫克的氧氟沙星储备溶液10微升，用90微升超纯水稀释。向含有LB琼脂培养基的六个玻璃烧瓶中加入增加体积的稀释氧氟沙星，以获得每毫升氧氟沙星0至0.1微克的最终浓度。
通过旋转烧瓶数次混合溶液，并将添加抗生素的LB琼脂培养基倒入六孔培养板中。让琼脂冷却直至凝固，并在使用前将板干燥。用PBS将过夜细菌培养物稀释至最终细胞密度为每毫升10至7CFU的1倍。
将两微升稀释的培养物点到干燥的六孔板的每个孔上。让斑点干燥，然后将板放入 37 摄氏度的培养箱中过夜。第二天，检查氧氟沙星浓度下抑制细菌菌落的生长。
将约25毫升准备好的LB琼脂倒入培养皿中。然后在每个固化和干燥的板上加入五到八个无菌玻璃珠。倒置并标记板。
接下来，制备含有900微升0.01摩尔硫酸镁溶液的十倍系列稀释玻璃管。在玻璃管中，在新鲜和温度调节的培养基中稀释过夜培养物至最终OD 600约0.001，并使培养物在培养箱中生长过夜。第二天，当OD 600达到0.3时，根据点测定数据转移100微升培养物进行稀释。
对细菌培养物进行十倍的连续稀释。然后将100微升稀释的培养物铺在制备的LB琼脂平板上。将所需浓度的氧氟沙星加入细菌培养物中，并在振荡的同时继续在37摄氏度下孵育。
在相关时间点，提取100微升培养物，并根据现场测定数据稀释培养物。在LB琼脂平板上平板上平板100微升稀释培养物。第二天，将过夜孵育板的菌落计数为可以检测到菌落的两个最高稀释度。
通过在 T0 处对每个时间点的 CFU 每毫升 CFU 进行归一化来计算存活率，并将对数基数 10 归一化值绘制为时间的函数。从微流体板的每个孔中取出保存溶液，并用新鲜培养基代替。通过单击"密封"按钮或通过微流体软件，用歧管系统密封微流体板。
接下来，在微流体软件界面上，通过单击运行液体启动序列来执行第一个启动序列。在开始显微镜成像之前，将板在显微镜的恒温控制柜中以37摄氏度孵育至少两个小时。然后在开始实验之前开始第二个运行液体启动序列。
通过单击微流体软件界面上的"解封板"来密封微流体板。用200微升新鲜培养基，含有抗生素的新鲜培养基和新鲜培养基中的0.01OD稀释培养样品替换孔中的培养基。如前所示密封微流控板后，将板放在显微镜柜内的显微镜物镜上。
在微流控软件中，单击"运行细胞加载序列"以允许将细胞加载到微流控板中。使用透射光模式设置最佳焦点，并选择几个感兴趣的区域，在这些区域，每个视场最多可以观察到 300 个像元的适当像元数。在微流控软件上，编辑运行自定义序列以编程将新鲜培养基以 6.9 千帕卡的速度注入一号和二号井 6 小时，然后以 6.9 千帕卡或 6 小时向三号井注入含有抗生素的培养基，最后以 6.9 千帕的新鲜培养基向四号和五号井注射 24 小时。
使用透射光和荧光报告基因的激发光源在延时模式下以每15分钟一帧进行显微镜成像，并启动微流体程序。在计算机上打开 ImageJ 或斐济软件，然后将超堆栈延时显微镜图像拖到斐济加载栏中。使用"图像"，然后使用"颜色"，然后使用"合成"来融合超堆栈的不同通道。
使用"图像"、"颜色"，如果通道与所需颜色不对应，请使用"排列通道"。打开 MicrobeJ 插件，使用手动编辑界面检测细菌细胞。删除自动检测到的单元格，并逐帧手动勾勒感兴趣的持久单元格。
检测后，使用 MicrobeJ 手动编辑界面中的 Result 图标生成 ResultJ 表。使用 ResultJ 表深入了解单细胞分析的不同感兴趣参数，并保存 ResultJ 文件。确定两种菌株的氧氟沙星MIC为0.06 μg/毫升，表明与同基因野生型菌株相比，hupA-mCherry融合不影响氧氟沙星的敏感性。
斑点测定显示分离的克隆随时间的适当稀释度，例如，在时间零处为10至负第五稀释。在定时杀灭测定中，观察到典型的双相曲线，其中第一个斜率反映了非持久性种群的快速杀灭。第二阶段显示出较慢的杀伤率，揭示了耐药持久性细胞的存在。
值得注意的是，时间杀灭曲线显示hupA-mCherry融合蛋白不影响定时杀动力学。在微流体实验中，第一个生长阶段表明细胞在氧氟沙星处理之前是有活力和分裂的。在第一个生长阶段之后，一旦抗生素到达细胞，细胞分裂就会被阻断。
氧氟沙星处理后，用新鲜培养基灌注，绝大多数细胞无法恢复生长。相比之下，一个小亚群可以伸长并产生丝状细胞，这些细胞被定义为持久性细胞。分裂的持久性细丝产生多个子细胞，其中大多数开始生长和分裂，类似于未处理的细胞。
细胞长度的增加与总mCherry荧光强度的增加相关，这反映了复制重启和类核丰度的增加。当使用含有细胞内报告基因的菌株来研究持久性时，与野生型菌株相比，报告基因的存在不会干扰生长、MIC和杀伤。这里描述的程序可以应用于其他条件和细菌种类，以监测细胞对环境或压力变化的反应。
通过在相同的设置中使用其他荧光报告基因，可以探测到对持久细胞生理学的新见解。
