הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה אינטגרטיבית המשלבת בדיקות מיקרוביולוגיה קלאסיות עם הדמיה חיה של תא בודד כדי לאפיין תאים מתמידים של Escherichia coli לאחר טיפול גבוה באופלוקסצין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לנתח את תופעת ההתמדה ברמת האוכלוסייה והתא הבודד. שילוב של אוכלוסייה ואנליזה של תא בודד מאפשר אפיון מולקולרי ותאי של פנוטיפ ההתמדה.
כדי להתחיל, פזרו את זן החיידקים המעניין ממלאי גליצרול קפוא על צלחת אגר LB, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לתקופה של 15 עד 19 שעות כדי להשיג מושבות בודדות. יש לחסן מושבה מבודדת בצינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של מדיום גידול MOPS בתוספת 0.4% גלוקוז, ובמידת הצורך להוסיף אנטיביוטיקה סלקטיבית למדיום. הניחו את הצינור באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד למשך הלילה.
למחרת, צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבית ב 2, 300 גרם במשך שלוש דקות כדי pellet את התאים, בעדינות resuspend את הגלולה עם אותו נפח של PBS. מדוד את ה-OD ב-600 ננומטר, וחשב את הנפח הדרוש ל-OD600 התחלתי של 0.01 בנפח סופי של שני מיליליטר. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של MOPS גליצרול 0.4% בינוני לתוך באר של צלחת שקופה, 24 בארות, וחסן עם נפח תרבית לילה מחושב.
הכנס את הצלחת בעלת 24 הקידוחים לקורא מיקרו-צלחות אוטומטי כדי לפקח על OD600 למשך 24 שעות. הגדר את קורא המיקרו-לוחות למדוד את OD600 כל 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ועם סיבוב מסלול גבוה של 140 סל"ד. ממיסים 100 מיליליטר של אגר LB, וממלאים את הבקבוק ב 55 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות.
הכינו שש צלוחיות זכוכית קטנות, ופיפטה חמישה מיליליטר של מדיום אגר LB נוזלי לכל בקבוק באמצעות פיפטה סטרילית. קח 10 מיקרוליטר של חמישה מיליגרם למיליליטר של תמיסת מלאי ofloxacin, ודלל 90 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד. הוסף נפחים הולכים וגדלים של ofloxacin מדולל לכל אחת משש צלוחיות זכוכית המכילות LB אגר בינוני כדי לקבל ריכוז סופי של אפס עד 0.1 מיקרוגרם למיליליטר של ofloxacin.
מערבבים את התמיסה על ידי סיבוב הצלוחיות מספר פעמים, ויוצקים את מצע האגר LB שהוסיף אנטיביוטיקה לצלחת תרבית בת שש בארות. מניחים לאגר להתקרר עד להתמצקות, ומייבשים את הצלחת לפני השימוש. לדלל תרבית חיידקים בן לילה לצפיפות תאים סופית של פי 10 עד 7 CFU למיליליטר עם PBS.
הבחינו בשני מיקרוליטרים של תרבית מדוללת על כל באר של צלחת שש בארות מיובשת. תנו לכתמים להתייבש לפני שתכניסו את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות למשך הלילה. למחרת, לבדוק באיזה ריכוז ofloxacin הצמיחה של מושבות חיידקים מעוכב.
יוצקים כ-25 מיליליטר של אגר LB מוכן לתוך צלחת פטרי. לאחר מכן הוסיפו חמישה עד שמונה חרוזי זכוכית סטריליים לכל צלחת מוצקה ומיובשת. הפוך ותייג את הצלחות.
לאחר מכן, הכינו צינורות זכוכית דילול סדרתי פי עשרה המכילים 900 מיקרוליטר של תמיסת מגנזיום סולפט 0.01 טוחנת. בצינור זכוכית, מדללים תרבית לילה בתווך טרי ומותאם טמפרטורה ל-OD600 סופי של כ-0.001, ומאפשרים לתרבית לגדול בן לילה באינקובטור. למחרת, כאשר OD600 מגיע 0.3, להעביר 100 מיקרוליטר של התרבות לדילול על פי נתוני הבדיקה נקודתית.
לבצע דילול סדרתי פי עשרה של תרבית החיידקים. ואז צלחת 100 מיקרוליטר של התרבות מדולל על לוחות אגר LB מוכן. מוסיפים את הריכוז הרצוי של אופלוקסצין לתרבית החיידקים, וממשיכים לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידה.
בנקודות הזמן הרלוונטיות, משכו 100 מיקרוליטר של התרבית, ודללו את התרבית בהתאם לנתוני הבדיקה הנקודתית. צלחת 100 מיקרוליטר של התרבות המדוללת על צלחות אגר LB. למחרת, ספרו את מושבות הלוחות המודגרים בלילה בשני הדילולים הגבוהים ביותר שעבורם ניתן לזהות מושבות.
חשב את יחס ההישרדות על ידי נרמול CFU למיליליטר בכל נקודת זמן ב- CFU למיליליטר ב- T0, והתווה את בסיס היומן 10 ערך מנורמל כפונקציה של זמן. הסר את תמיסת השימור מכל באר של הצלחת המיקרופלואידית, והחלף אותה במדיום תרבית טרי. אטמו את הצלחת המיקרופלואידית עם מערכת הסעפת על ידי לחיצה על כפתור האטימה או באמצעות התוכנה המיקרופלואידית.
לאחר מכן, בממשק התוכנה microfluidic, בצע רצף ראשוני ראשון על ידי לחיצה על Run Liquid Priming Sequence. יש לדגור על הצלחת בארון מבוקר תרמוסטטית של המיקרוסקופ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות לפני תחילת ההדמיה במיקרוסקופיה. לאחר מכן התחל רצף הפעלה נוזלי שני לפני תחילת הניסוי.
אטם את הצלחת המיקרופלואידית על ידי לחיצה על Unseal Plate בממשק התוכנה המיקרופלואידית. החליפו את התווך בבארות ב-200 מיקרוליטר מדיום טרי, אנטיביוטיקה המכילה מדיום טרי, ודגימת תרבית מדוללת 0.01 OD בתווך הטרי. לאחר איטום הצלחת המיקרופלואידית כפי שהודגם קודם, הניחו את הצלחת על מטרת המיקרוסקופ בתוך ארון המיקרוסקופ.
בתוכנה microfluidic, לחץ על Run Cell Loading Sequence כדי לאפשר טעינה של התאים לתוך הצלחת microfluidic. הגדר מיקוד אופטימלי באמצעות מצב האור המשודר, ובחר מספר אזורי עניין שבהם ניתן לצפות במספר תאים מתאים של עד 300 תאים לכל שדה. בתוכנה המיקרופלואידית, ערוך את Run a Custom Sequence כדי לתכנת את הזרקת התווך הטרי ב-6.9 קילופסקל למשך שש שעות לבארות אחת ושתיים, לאחר מכן התווך המכיל אנטיביוטיקה ב-6.9 קילופסקל או שש שעות לבאר שלוש, ולבסוף התווך הטרי ב-6.9 קילופסקל למשך 24 שעות לבארות ארבע וחמש.
בצע הדמיה מיקרוסקופית במצב קיטועי זמן עם פריים אחד כל 15 דקות באמצעות האור המשודר ומקור אור העירור עבור כתב הפלואורסצנט, והתחל את התוכנית המיקרופלואידית. פתח את תוכנת ImageJ או Fiji במחשב וגרור את התמונות במיקרוסקופ עם קיטועי זמן של hyperstack לסרגל הטעינה של פיג'י. השתמשו ב'תמונה', ולאחר מכן 'צבע', ולאחר מכן 'צור ללא הפרדות צבע' כדי להתיך את הערוצים השונים של ערימת ההיפר-ערימה.
השתמשו ב'תמונה', 'צבע' ולאחר מכן 'סדרו ערוצים' אם הערוצים אינם תואמים לצבע הרצוי. פתחו את תוסף MicrobeJ וזהו את תאי החיידקים באמצעות ממשק העריכה הידני. מחק את התאים שזוהו באופן אוטומטי ושרטט באופן ידני את התאים המתמידים בעלי תחומי העניין מסגרת אחר מסגרת.
לאחר הזיהוי, השתמש בסמל התוצאה בממשק העריכה הידני של MicrobeJ כדי ליצור טבלת ResultJ. השתמש בטבלת ResultJ כדי לקבל תובנות לגבי פרמטרים שונים המעניינים את ניתוח התא הבודד ושמור את קובץ ResultJ. ה-MIC של אופלוקסצין עבור שני הזנים נקבע כ-0.06 מיקרוגרם למיליליטר, מה שמצביע על כך שהיתוך hupA-mCherry לא השפיע על הרגישות של אופלוקסצין בהשוואה לזן איזוגני מסוג בר.
הבדיקה הספוטית הראתה שיבוטים מבודדים בדילול מתאים לאורך זמן, לדוגמה, 10 לדילול החמישי השלילי בזמן אפס. במבחן ההרג בזמן נצפתה עקומה ביפאזית טיפוסית שבה המדרון הראשון משקף את ההרג המהיר של האוכלוסייה הלא מתמידה. השלב השני הראה קצב הרג איטי יותר, וחשף את נוכחותם של תאים מתמידים עמידים לתרופות.
יש לציין שעקומת הזמן-הרג מראה כי חלבון ההיתוך hupA-mCherry לא השפיע על קינטיקה של הרג זמן. בניסוי המיקרופלואיד, שלב הגידול הראשון מצביע על כך שהתאים היו בני קיימא והתחלקו לפני הטיפול באופלוקסצין. לאחר שלב גדילה ראשון זה, חלוקת התאים נחסמה ברגע שהאנטיביוטיקה הגיעה לתאים.
לאחר טיפול באופלוקסצין, על זילוח עם מדיום טרי, הרוב המכריע של התאים לא הצליחו לחדש את הצמיחה. לעומת זאת, תת-אוכלוסייה קטנה יכולה להתארך ולייצר תאים נימיים, המוגדרים כתאים המתמידים. חוט הלהט המתמיד המתחלק יצר תאי בת מרובים, שרובם החלו לגדול ולהתחלק בדומה לתאים לא מטופלים.
העלייה באורך התא הייתה בקורלציה עם עלייה בעוצמה הפלואורסצנטית הכוללת של mCherry, המשקפת הפעלה מחדש של השכפול ועלייה בשפע הנוקלאואידים. כאשר משתמשים בזן המכיל כתב תוך-תאי לחקר התמדה, חשוב שנוכחותו של המדווח לא תפריע לצמיחה, מיקרופון והרג בהשוואה לזן פראי. ההליך המתואר כאן יכול להיות מיושם על תנאים אחרים ומיני חיידקים כדי לנטר תגובות תאיות לסביבות משתנות או לעקה.
על ידי שימוש בכתבים פלואורסצנטיים אחרים במערך זהה, ניתן לחקור תובנות חדשות על הפיזיולוגיה של תאים מתמידים.
