ここで説明するプロトコルは、高オフロキサシン処理後の大腸菌持続細胞を特徴付けるために、古典的な微生物学アッセイとシングルセルライブイメージングを組み合わせた統合方法を提供します。この手法の主な利点は、集団および単一細胞レベルで持続現象を解析できることです。集団解析とシングルセル解析を組み合わせることで、持続性表現型の分子的および細胞的特性評価が可能になります。
まず、LB寒天プレート上の凍結グリセロールストックから目的の細菌株をストリークし、摂氏37度で一晩15〜19時間インキュベートして、単一のコロニーを取得します。単離したコロニーを、0.4%グルコースを添加した5ミリリットルのMOPS増殖培地を含むガラス管に接種し、必要に応じて選択的抗生物質を培地に加えます。チューブを摂氏37度、180rpmで一晩振とうインキュベーターに入れます。
翌日、培養液1ミリリットルを2,300gで3分間遠心分離して細胞をペレット化し、ペレットを同容量のPBSで穏やかに再懸濁した。600ナノメートルでODを測定し、2ミリリットルの最終体積で0.01の初期OD600に必要な体積を計算します。次に、透明底24ウェルプレートのウェルに2ミリリットルのMOPSグリセロール0.4%培地を加え、計算した一晩培養量を接種します。
24ウェルプレートを自動マイクロプレートリーダーに入れて、OD600を24時間監視します。マイクロプレートリーダーを、摂氏37度の温度と140rpmの高い軌道回転で15分ごとにOD600を測定するように設定します。100ミリリットルのLB寒天を溶かし、固化を避けるために摂氏55度でフラスコをストックします。
6つの小さなガラスフラスコを準備し、滅菌ピペットを使用して5ミリリットルの液体LB寒天培地を各フラスコにピペットで入れます。5ミリグラム/ミリリットルのロキサシン原液を10マイクロリットル取り、90マイクロリットルの超純水で希釈する。LB寒天培地を含む6つのガラスフラスコのそれぞれに希釈オフロキサシンの量を増やして、オフロキサシン1ミリリットルあたり0〜0.1マイクログラムの最終濃度を得る。
フラスコを数回回転させて溶液を混合し、抗生物質を添加したLB寒天培地を6ウェル培養プレートに注ぎます。寒天が固まるまで冷まし、プレートを乾かしてからご使用ください。一晩の細菌培養物をPBSで1ミリリットルあたり10〜7分の1のCFUの最終細胞密度に希釈します。
乾燥した6ウェルプレートのすべてのウェルに2マイクロリットルの希釈培養物を見つけます。プレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩入れる前に、スポットを乾かします。翌日、どのオフロキサシン濃度で細菌コロニーの増殖が阻害されているかを確認します。
準備したLB寒天約25ミリリットルをペトリ皿に注ぎます。次に、5〜8個の滅菌ガラスビーズを各固化および乾燥プレートに追加します。プレートを反転してラベルを付けます。
次に、900マイクロリットルの0.01モル硫酸マグネシウム溶液を含む10倍段階希釈ガラス管を調製する。ガラス管で、新鮮な温度調整培地で一晩培養を最終OD600約0000に希釈し、培養液をインキュベーターで一晩増殖させます。翌日、OD600が0.3に達したら、スポットアッセイデータに従って希釈用の培養液100マイクロリットルを移す。
細菌培養物の10倍連続希釈を行う。次に、調製したLB寒天プレート上に100マイクロリットルの希釈培養液をプレート化する。所望の濃度のオフロキサシンを細菌培養物に加え、振とうしながら摂氏37度でインキュベートを続けます。
関連する時点で、100マイクロリットルの培養液を回収し、スポットアッセイデータに応じて培養液を希釈します。希釈培養液を100マイクロリットルのLB寒天プレート上にプレート化する。翌日、一晩インキュベートしたプレートのコロニーを、コロニーを検出できる2つの最も高い希釈率でカウントします。
T0でのミリリットルあたりのCFUで各時点でのミリリットルあたりのCFUを正規化して生存率を計算し、時間の関数として正規化された対数ベース10の値をプロットします。マイクロ流体プレートのすべてのウェルから保存液を取り出し、新鮮な培地と交換します。マニホールドシステムでマイクロ流体プレートをシールするには、シールボタンをクリックするか、マイクロ流体ソフトウェアを使用します。
次に、マイクロ流体ソフトウェアインターフェースで、[液体プライミングシーケンスの実行]をクリックして最初のプライミングシーケンスを実行します。顕微鏡イメージングを開始する前に、顕微鏡の恒温槽内で摂氏37度で最低2時間インキュベートします。次に、実験を開始する前に、2回目の液体プライミングシーケンスの実行を開始します。
マイクロ流体ソフトウェアインターフェースのプレートのシール解除をクリックして、マイクロ流体プレートをシールします。ウェル内の培地を、200マイクロリットルの新鮮な培地、抗生物質を含む新鮮な培地、および新鮮な培地中の0.01 OD希釈培養サンプルと交換します。前述のようにマイクロ流体プレートを密封した後、顕微鏡キャビネット内の顕微鏡対物レンズにプレートを置きます。
マイクロ流体ソフトウェアで、細胞ローディングシーケンスの実行をクリックして、細胞をマイクロ流体プレートにロードできるようにします。透過光モードを使用して最適な焦点を設定し、フィールドあたり最大300セルの適切なセル数を観察できるいくつかの関心領域を選択します。マイクロ流体ソフトウェアで、カスタムシーケンスの実行を編集して、ウェル1と2に6.9キロパスカルの新鮮な培地を6時間注入し、続いて抗生物質を含む培地を6.9キロパスカルまたは6時間でウェル3に注入し、最後に新鮮な培地を6.9キロパスカルでウェル4と5に24時間注入します。
透過光と蛍光レポーターの励起光源を用いて、15分毎に1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを行い、マイクロ流体プログラムを開始します。コンピューターでImageJまたはFijiソフトウェアを開き、ハイパースタックタイムラプス顕微鏡画像をフィジーのローディングバーにドラッグします。[イメージ]、[カラー]、[合成の作成] の順に使用して、ハイパースタックのさまざまなチャネルを融合します。
「画像」、「カラー」を使用し、チャンネルが目的の色に対応していない場合は「チャンネルを配置」を使用します。MicrobeJプラグインを開き、手動編集インターフェイスを使用して細菌細胞を検出します。自動的に検出されたセルを削除し、目的の永続セルの輪郭をフレームごとに手動で作成します。
検出後、MicrobeJ 手動編集インターフェイスの結果アイコンを使用して、ResultJ テーブルを生成します。ResultJ 表を使用して、単一セル解析の対象となるさまざまなパラメータに関する洞察を得て、ResultJ ファイルを保存します。両株のオフロキサシンのMICは0.06マイクログラム/ミリリットルと決定され、hupA-mCherry融合は同質遺伝子野生株と比較してオフロキサシンの感受性に影響を及ぼさないことが示された。
スポットアッセイは、時間経過に伴う適切な希釈、例えば時間ゼロにおける10〜負の第5希釈で単離されたクローンを示した。タイムキルアッセイでは、最初の傾きが非持続性集団の急速な殺傷を反映する典型的な二相性曲線が観察されました。第2段階では殺傷速度が遅くなり、薬剤耐性持続細胞の存在が明らかになりました。
特に、タイムキル曲線は、hupA-mCherry融合タンパク質がタイムキル動態に影響を及ぼさないことを示しています。マイクロ流体実験では、最初の増殖期は、細胞がオフロキサシン処理前に生存し、分裂していたことを示しています。この最初の成長段階の後、抗生物質が細胞に到達するとすぐに細胞分裂がブロックされました。
オフロキサシン処理後、新鮮な培地で灌流すると、大多数の細胞は増殖を再開することができなかった。対照的に、小さな亜集団は伸長し、持続性細胞として定義される糸状細胞を生成する可能性があります。分裂持続性フィラメントは複数の娘細胞を生成し、そのほとんどは未処理の細胞と同様に成長し、分裂し始めました。
細胞長の増加は、総mCherry蛍光強度の増加と相関しており、これは複製の再開と核様体存在量の増加を反映しています。細胞内レポーターを含む株を使用して持続性を研究する場合、レポーターの存在が野生株と比較して成長、MIC、および殺傷を妨げないことは帝国です。ここで説明する手順は、変化する環境またはストレスに対する細胞応答をモニターするために、他の条件および細菌種に適用することができる。
同じ設定で他の蛍光レポーターを使用することにより、持続性細胞の生理機能に関する新しい洞察を調べることができます。
