询问氧磷和糖酵解的实时生物能量谱正在成为表征 RPE 健康和功能的关键因素。高分辨率呼吸测量法可以有效地比较正常和患病 RPE 的代谢状态。该技术的优点是通过测量耗氧速率，OCR和细胞外酸化速率ECAR同时探索oxphos和糖酵解。
RPE细胞是高度代谢活跃的细胞，是AMD期间最早退化的细胞之一。了解它们的代谢和线粒体功能，使得开发新药成为可能。首先，在人RPE培养基中每孔添加100微升细胞悬液，最终浓度为每100微升20， 000个细胞。
并确保将四个角井留空。上下移液多次以确保细胞悬液均匀，使用多通道移液器以获得轻松和一致。仅向四个空角孔中加入 100 微升培养基以进行背景校正。
将细胞培养板在室温下放置一小时，以帮助最大限度地减少边缘效应。然后将其放入装有5%二氧化碳的培养箱中，37摄氏度加湿。孵育过夜后，在显微镜下检查细胞以检查其形态和色素沉着水平，然后再更换培养基。
在随后的检查日，确保细胞与特征性的鹅卵石样形态汇合，并随着时间的推移获得色素沉着。为确保在测定前一天传感器盒的水合作用，用200微升去离子水填充实用板的每个孔，并将传感器盒浸没在水中放在实用板上。将大约 20 毫升校准溶液在不含二氧化碳的 37 摄氏度加湿烤箱中过夜。
打开高分辨率呼吸测量仪并启动软件，让仪器在 37 摄氏度下稳定过夜。在测定当天，在运行测定前至少45分钟用等体积的加热校准溶液替换实用板中的水。将25毫升制备好的不含酚红的Mito压力测试测定培养基加热至37摄氏度，并真空过滤pH值为7.4的调节培养基，使用管顶过滤单元。
从细胞培养板中取出人RPE培养基，并加入100微升新鲜制备的测定培养基。然后将细胞培养板放入不含二氧化碳的37摄氏度加湿炉中一小时，然后再开始测定。每个传感器盒每个孔有四个试剂输送端口，用于在测定过程中将测试化合物注入细胞培养板孔中。
通过在各自的测定培养基中稀释药物储备液，每个制备三毫升Tenex药物溶液。接下来，将 20 微升 Tenex 药物原液移液到端口 A 中，将 22 微升移液到端口 B 中，将 25 微升移液到端口 C 中，以达到每个孔中指定的最终药物浓度。接下来在分析软件中，打开模板选项卡，选择 Mito 压力测试并填写组定义。
输入有关Mito压力测试药物注射策略的详细信息。然后输入测定中不同实验组的详细信息以进行对照或治疗。输入有关测定培养基的详细信息，以将不同的添加剂及其特定浓度添加到基础测定培养基中。
最后，添加单元格类型。单击下一个选项卡，然后单击板图，将不同的检查组分配到其在 96 孔板上的特定位置。完成板图后，单击协议选项卡以查看默认 Mito 压力测试协议的仪器协议。
然后单击运行测定，并将传感器盒插入，浸没在实用板的校准溶液中进行校准。此过程大约需要25分钟，每个生物传感器都会根据已知pH和氧气浓度的校准溶液中测量的传感器输出进行独立校准。校准完成后，取下实用板并插入细胞培养板。
基线测量后，仪器自动将端口A药物溶液注入每个孔中，该孔经过三个混合和测量循环，每个循环三分钟。在随后的每次药物注射后，都会发生相同的模式。运行完成后，取出细胞培养板和传感器盒。
出于质量控制目的，通过检查端口是否有残留药物，确保所有药物端口和传感器盒均已注射。接下来，在显微镜下检查细胞培养微孔板中的细胞，以确保细胞的汇合单层。然后丢弃测定培养基，并在每个孔中用60微升一个x裂解缓冲液代替。
用封口膜包裹板的边缘以防止蒸发，并将其放入零下80摄氏度的冰箱中，以帮助在使用BCA测定定量蛋白质含量之前进行细胞裂解过夜。根据数据分析，通过将耗氧率或 OCR 和细胞外酸化率或 ECAR 值除以每个孔中蛋白质的微克数来标准化所有数据。然后导出 Mito 压力测试报告生成器，该生成器利用 Excel 宏使用数据分析软件自动计算 Mito 压力测试参数。
通过遵循与Mito应激试验相同的步骤，可以进行糖酵解应激试验，但分析培养基补充剂和药物注射液除外，如表1和表2所示。该仪器在每次运行时同时测量 OCR 和 ECAR。对于Mito压力测试，周长计算基于OCAR读数，而对于糖酵解压力测试，参数计算基于ECAR读数。
这是对原代人RPE细胞进行Mito压力测试产生的OCR曲线。Mito应力测试参数的计算显示为条形图。同样，这是通过对原代人RPE细胞进行糖酵解应激测试而产生的ECAR曲线，计算结果显示为条形图。
为了优化用于Mito应激测试的端口B药物注射，比较了两种解偶联剂在增加原代人RPE细胞OCR方面的功效。研究发现，BAM15在增强线粒体呼吸能力方面优于FCCP，与FCCP相比，BAM15的最大呼吸和备用呼吸能力显着更高。重要的是要记住在运行测定前一天对传感器盒进行水合。
该技术使研究人员能够更好地表征RPE细胞的生物能量特征，并了解RPE细胞如何表现出代谢灵活性以响应不同的致病刺激。
