L’interrogation des profils bioénergétiques en temps réel de l’oxphos et de la glycolyse est en train de devenir un facteur clé dans la caractérisation de la santé et de la fonction des EPR. La respirométrie à haute résolution permet de comparer efficacement l’état métabolique de l’EPR normal et malade. Cette technique présente l’avantage d’explorer simultanément à la fois l’oxphos et la glycolyse grâce à une mesure du taux de consommation d’oxygène, de l’OCR et du taux d’acidification extracellulaire, ECAR.
Les cellules EPR sont des cellules hautement métaboliquement actives et sont l’une des premières cellules à dégénérer au cours de la DMLA. Comprendre leur fonction métabolique et mitochondriale, permet de développer de nouveaux médicaments. Pour commencer, ajoutez 100 microlitres par puits de la suspension cellulaire dans le milieu EPR humain à une concentration finale de 20 000 cellules par 100 microlitres dans chaque puits.
Et assurez-vous de laisser les quatre puits d’angle vides. Pipeter plusieurs fois de haut en bas pour assurer une suspension cellulaire homogène, en utilisant une pipette multicanal pour plus de facilité et de cohérence. Ajoutez 100 microlitres de média uniquement aux quatre puits d’angle vides pour la correction de l’arrière-plan.
Laissez la plaque de culture cellulaire à température ambiante pendant une heure pour aider à minimiser les effets de bord. Ensuite, placez-le dans l’incubateur avec 5% de dioxyde de carbone 37 degrés Celsius et humidifié. Après une incubation de nuit, examiner les cellules au microscope pour vérifier leur morphologie et leur niveau de pigmentation avant de changer le milieu.
Les jours d’examen suivants, assurez-vous que les cellules sont confluentes avec une morphologie pavée caractéristique et acquièrent une pigmentation au fil du temps. Pour assurer l’hydratation de la cartouche du capteur la veille du test, remplissez chaque puits de la plaque utilitaire avec 200 microlitres d’eau désionisée et placez la cartouche du capteur, immergée dans l’eau sur la plaque utilitaire. Conservez environ 20 millilitres de la solution d’étalonnage pendant la nuit dans un four humidifié à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone.
Allumez l’instrument de respirométrie haute résolution et démarrez le logiciel pour permettre à l’instrument de se stabiliser à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour de l’essai, remplacer l’eau dans la plaque utilitaire par un volume égal de solution d’étalonnage chauffée au moins 45 minutes avant l’exécution de l’essai. Réchauffer 25 millilitres du milieu d’essai de stress Mito préparé sans rouge de phénol à 37 degrés Celsius et filtrer sous vide le média ajusté à pH 7,4, à l’aide d’une unité de filtration supérieure tubulaire.
Retirer le milieu humain EPR de la plaque de culture cellulaire et ajouter 100 microlitres de milieux de dosage fraîchement préparés. Ensuite, placez la plaque de culture cellulaire dans un four humidifié à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant une heure avant de commencer le test. Chaque cartouche de capteur dispose de quatre orifices de distribution de réactif par puits pour injecter les composés d’essai dans des puits de plaques de culture cellulaire pendant le test.
Préparer trois millilitres des solutions médicamenteuses Tenex chacune, en diluant les stocks de médicaments dans leurs milieux de dosage respectifs. Ensuite, pipeter 20 microlitres du stock de médicaments Tenex dans le port A, 22 microlitres dans le port B et 25 microlitres dans le port C pour atteindre la concentration finale spécifiée dans chaque puits. Ensuite, dans le logiciel d’analyse, ouvrez l’onglet modèles, sélectionnez Test de contrainte Mito et remplissez les définitions de groupe.
Détails sur la stratégie d’injection pour les médicaments soumis au test de résistance Mito. Ensuite, entrez des détails sur les différents groupes expérimentaux dans le test pour le contrôle ou le traitement. Détails d’entrée sur les milieux de dosage pour l’ajout de différents suppléments et leurs concentrations spécifiques dans les milieux d’essai de base.
Et enfin, ajoutez le type de cellule. Cliquez sur l’onglet suivant, puis sur Carte des plaques pour affecter différents groupes examinés à leur emplacement spécifique sur la plaque de 96 puits. Une fois la carte des plaques terminée, cliquez sur l’onglet protocole pour consulter le protocole d’instrument correspondant au protocole de test de contrainte Mito par défaut.
Cliquez ensuite sur exécuter le test et insérez la cartouche du capteur, immergée dans la solution d’étalonnage dans la plaque utilitaire pour l’étalonnage. Ce processus prend environ 25 minutes et chaque biocapteur est étalonné indépendamment, en fonction de la sortie du capteur mesurée dans la solution d’étalonnage dont le pH et la concentration en oxygène sont connus. Une fois l’étalonnage terminé, retirez la plaque utilitaire et insérez la plaque de culture cellulaire.
Après la mesure de base, l’instrument injecte automatiquement la solution médicamenteuse de Port A dans chaque puits, qui suit trois boucles de mélange et de mesure, trois minutes chacune. Le même schéma se produit après chaque injection de drogue subséquente dans les autres ports. Une fois l’exécution terminée, retirez la plaque de culture cellulaire et la cartouche du capteur.
À des fins de contrôle de la qualité, assurez-vous que tous les ports de médicament et la cartouche de capteur ont été injectés en examinant les orifices pour ne pas rester de médicament résiduel. Ensuite, examinez les cellules de la microplaque de culture cellulaire au microscope pour vous assurer de la monocouche confluente des cellules. Ensuite, jetez le milieu de dosage et remplacez-le par 60 microlitres d’un x tampon de lyse dans chaque puits.
Enveloppez les bords de la plaque dans du parafilm pour éviter l’évaporation et placez-la dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pour faciliter la lyse cellulaire pendant la nuit avant de quantifier la teneur en protéines, à l’aide du test BCA. Par analyse des données, normaliser toutes les données en divisant le taux de consommation d’oxygène ou OCR et le taux d’acidification extracellulaire ou les valeurs ECAR par les microgrammes de protéines dans chaque puits. Exportez ensuite le générateur de rapports de test de contrainte Mito, qui utilise des macros Excel pour calculer automatiquement les paramètres du test de contrainte Mito à l’aide du logiciel d’analyse de données.
En suivant les mêmes étapes que celles démontrées pour le test de résistance de Mito, le test de stress glycolytique peut être effectué, à l’exception des suppléments de milieu opératoire et des injections de médicaments qui sont différents, comme le montrent les tableaux un et deux. L’instrument mesure simultanément l’OCR et l’ECAR pour chaque course. Pour le test de contrainte Mito, les calculs de périmètre sont basés sur les lectures OCAR, tandis que pour le test de contrainte glycolytique, les calculs de paramètres sont basés sur les lectures ECAR.
Voici une courbe OCR générée par l’exécution du test de stress de Mito sur des cellules RPE humaines primaires. Les calculs des paramètres du test de contrainte Mito sont affichés sous forme de graphiques à barres. De même, il s’agit de la courbe ECAR, générée par l’exécution du test de stress glycolytique sur les cellules RPE humaines primaires et les calculs sont présentés sous forme de graphiques à barres.
Pour optimiser l’injection de médicament au port B pour le test de stress de Mito, l’efficacité de deux agents de découplage dans l’augmentation de l’OCR dans les cellules EPR humaines primaires a été comparée. BAM15 s’est avéré supérieur au FCCP dans l’amélioration de la capacité respiratoire mitochondriale, comme en témoigne la respiration maximale significativement plus élevée et la capacité respiratoire de réserve avec BAM15, par rapport au FCCP. Il est important de ne pas oublier d’hydrater la cartouche du capteur la veille de l’exécution du test.
Cette technique permet aux chercheurs de mieux caractériser les profils bioénergétiques des cellules EPR et de comprendre comment les cellules EPR présentent une flexibilité métabolique en réponse à différents stimuli pathogènes.
