يبرز استجواب ملامح الطاقة الحيوية في الوقت الفعلي للأوكسفوس وتحلل السكر كعامل رئيسي في توصيف صحة RPE ووظيفتها. يتيح قياس التنفس عالي الدقة طريقة فعالة لمقارنة الحالة الأيضية ل RPE الطبيعي والمريض. تتميز هذه التقنية بالاستكشاف المتزامن لكل من oxphos وتحلل السكر من خلال قياس معدل استهلاك الأكسجين ، OCR ومعدل التحمض خارج الخلية ، ECAR.
خلايا RPE هي خلايا نشطة للغاية من الناحية الأيضية وهي واحدة من أولى الخلايا التي تتدهور أثناء AMD. فهم وظيفة التمثيل الغذائي والميتوكوندريا ، يجعل من الممكن تطوير أدوية جديدة. للبدء ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من معلق الخلية في وسط RPE البشري إلى تركيز نهائي يبلغ 20،000 خلية لكل 100 ميكرولتر في كل بئر.
وتأكد من ترك آبار الزاوية الأربعة فارغة. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان تعليق خلية متجانسة ، باستخدام ماصة متعددة القنوات لسهولة واتساق. أضف 100 ميكرولتر من الوسائط فقط إلى آبار الزاوية الأربعة الفارغة لتصحيح الخلفية.
اترك لوحة زراعة الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للمساعدة في تقليل تأثيرات الحافة. ثم ضعه في الحاضنة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية وترطيبها. بعد الحضانة الليلية ، افحص الخلايا الموجودة تحت المجهر للتحقق من مورفولوجيتها ومستوى تصبغها قبل تغيير الوسائط.
في أيام الفحص اللاحقة ، تأكد من أن الخلايا متقاربة مع مورفولوجيا مميزة تشبه الحصى وتكتسب تصبغا بمرور الوقت. لضمان ترطيب خرطوشة المستشعر في اليوم السابق للفحص ، املأ كل بئر من لوحة المرافق ب 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات وضع خرطوشة المستشعر المغمورة في الماء على لوحة المرافق. احتفظ بحوالي 20 ملليلترا من محلول المعايرة طوال الليل في فرن مرطب بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون.
قم بتشغيل أداة قياس التنفس عالية الدقة وابدأ تشغيل البرنامج للسماح للأداة بالاستقرار عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في يوم الفحص ، استبدل الماء الموجود في لوحة المرافق بحجم متساو من محلول المعايرة الدافئ قبل 45 دقيقة على الأقل من تشغيل الفحص. قم بتسخين 25 ملليلتر من وسائط فحص اختبار الإجهاد Mito المحضرة بدون الفينول الأحمر إلى 37 درجة مئوية وتصفية الوسائط المعدلة بدرجة الحموضة 7.4 ، باستخدام وحدة مرشح أعلى الأنبوب.
قم بإزالة وسائط RPE البشرية من لوحة زراعة الخلايا وأضف 100 ميكرولتر من وسائط الفحص المحضرة حديثا. ثم ضع طبق زراعة الخلايا في فرن مرطب بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة قبل بدء الفحص. تحتوي كل خرطوشة مستشعر على أربعة منافذ توصيل كاشف لكل بئر لحقن مركبات الاختبار في آبار لوحة زراعة الخلايا أثناء الفحص.
قم بإعداد ثلاثة ملليلتر من محاليل الأدوية Tenex لكل منها ، عن طريق تخفيف مخزون الأدوية في وسائط الفحص الخاصة بها. بعد ذلك ، ماصة 20 ميكرولتر من مخزون أدوية Tenex في المنفذ A ، و 22 ميكرولتر في المنفذ B و 25 ميكرولتر في المنفذ C لتحقيق تركيز الدواء النهائي المحدد في كل بئر. بعد ذلك في برنامج التحليل ، افتح علامة تبويب القوالب ، وحدد اختبار الإجهاد Mito واملأ تعريفات المجموعة.
تفاصيل المدخلات حول استراتيجية الحقن لعقاقير اختبار الإجهاد Mito. ثم أدخل تفاصيل عن المجموعات التجريبية المختلفة في الفحص للتحكم أو العلاج. تفاصيل الإدخال على وسائط الفحص لإضافة مكملات مختلفة وتركيزاتها المحددة إلى وسائط الفحص الأساسية.
وأخيرا ، أضف نوع الخلية. انقر فوق علامة التبويب التالية ثم على خريطة اللوحة لتعيين مجموعات مختلفة قيد الفحص لموقعها المحدد على لوحة البئر 96. عند الانتهاء من خريطة اللوحة ، انقر فوق علامة تبويب البروتوكول لمراجعة بروتوكول الأداة لبروتوكول اختبار الإجهاد Mito الافتراضي.
ثم انقر فوق تشغيل الفحص ، وأدخل خرطوشة المستشعر ، المغمورة في محلول المعايرة في لوحة المرافق للمعايرة. تستغرق هذه العملية حوالي 25 دقيقة ويتم معايرة كل مستشعر حيوي بشكل مستقل ، بناء على خرج المستشعر المقاس في محلول المعايرة بتركيز الأس الهيدروجيني والأكسجين المعروف. عند الانتهاء من المعايرة ، قم بإزالة لوحة المرافق وأدخل لوحة زراعة الخلية.
بعد قياس خط الأساس ، تقوم الأداة تلقائيا بحقن محلول الدواء Port A في كل بئر يتبع ثلاث حلقات من الخلط والقياس ، ثلاث دقائق لكل منها. يحدث نفس النمط بعد كل حقن دواء لاحق في المنافذ الأخرى. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بإزالة لوحة زراعة الخلايا وخرطوشة المستشعر.
لأغراض مراقبة الجودة ، تأكد من حقن جميع منافذ الدواء وخرطوشة المستشعر عن طريق فحص المنافذ بحثا عن عدم وجود بقايا أدوية متبقية. بعد ذلك ، افحص الخلايا الموجودة في الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا تحت المجهر للتأكد من تلاقى الطبقة الأحادية للخلايا. ثم تخلص من وسائط الفحص واستبدلها ب 60 ميكرولترا من مخزن مؤقت x تحلل واحد في كل بئر.
لف حواف اللوحة في بارافيلم لمنع التبخر ، وضعها في مجمد سالب 80 درجة مئوية للمساعدة في تحلل الخلية طوال الليل قبل تحديد كمية محتوى البروتين ، باستخدام مقايسة BCA. لكل تحليل للبيانات ، قم بتطبيع جميع البيانات بقسمة معدل استهلاك الأكسجين أو OCR ومعدل التحمض خارج الخلية أو قيم ECAR على ميكروغرام من البروتين في كل بئر. ثم قم بتصدير منشئ تقرير اختبار الإجهاد Mito ، والذي يستخدم وحدات ماكرو Excel لحساب معلمات اختبار الإجهاد Mito تلقائيا باستخدام برنامج تحليل البيانات.
باتباع نفس الخطوات الموضحة لاختبار إجهاد ميتو ، يمكن إجراء اختبار الإجهاد تحلل السكر ، باستثناء مكملات وسائط الفحص وحقن الأدوية المختلفة كما هو موضح في الجدول الأول والجدول الثاني. تقيس الأداة في وقت واحد كلا من OCR و ECAR لكل تشغيل. بالنسبة لاختبار إجهاد ميتو ، تستند حسابات المحيط إلى قراءات OCAR ، بينما بالنسبة لاختبار الإجهاد المحلل للسكر ، تستند حسابات المعلمات إلى قراءات ECAR.
فيما يلي منحنى OCR الناتج عن إجراء اختبار إجهاد Mito على خلايا RPE البشرية الأولية. يتم عرض حسابات معلمات اختبار الإجهاد Mito كرسوم بيانية شريطية وبالمثل ، هذا هو منحنى ECAR ، الناتج عن إجراء اختبار الإجهاد تحلل السكر على خلايا RPE البشرية الأولية ويتم عرض الحسابات كرسوم بيانية شريطية
لتحسين حقن دواء المنفذ B لاختبار إجهاد ميتو ، تمت مقارنة فعالية عاملين منفصلين في زيادة التعرف الضوئي على الحروف في خلايا RPE البشرية الأولية. وجد أن BAM15 يتفوق على FCCP في تعزيز القدرة التنفسية للميتوكوندريا كما يتضح من التنفس الأقصى الأعلى بشكل ملحوظ والقدرة التنفسية الاحتياطية مع BAM15 ، مقارنة ب FCCP. من المهم أن تتذكر ترطيب خرطوشة المستشعر في اليوم السابق لتشغيل الفحص.
تسمح هذه التقنية للباحثين بتوصيف ملامح الطاقة الحيوية لخلايا RPE بشكل أفضل وفهم كيف تظهر خلايا RPE مرونة أيضية استجابة للمحفزات المسببة للأمراض المختلفة.
