L'interrogazione in tempo reale dei profili bioenergetici di oxphos e glicolisi sta emergendo come un fattore chiave nella caratterizzazione della salute e della funzione RPE. La respirometria ad alta risoluzione consente un modo efficiente di confrontare lo stato metabolico dell'RPE normale e malato. Questa tecnica ha il vantaggio di esplorare simultaneamente sia l'oxphos che la glicolisi attraverso una misurazione del tasso di consumo di ossigeno, OCR e tasso di acidificazione extracellulare, ECAR.
Le cellule RPE sono cellule altamente metabolicamente attive e sono una delle prime cellule a degenerare durante l'AMD. Comprendere la loro funzione metabolica e mitocondriale, rende possibile lo sviluppo di nuovi farmaci. Per iniziare, aggiungere 100 microlitri per pozzetto della sospensione cellulare nel mezzo RPE umano a una concentrazione finale di 20.000 cellule per 100 microlitri in ciascun pozzetto.
E assicurati di lasciare vuoti i quattro pozzi angolari. Pipettare su e giù più volte per garantire una sospensione cellulare omogenea, utilizzando una pipetta multicanale per facilità e consistenza. Aggiungi 100 microlitri di supporto solo ai quattro pozzetti angolari vuoti per la correzione dello sfondo.
Lasciare la piastra di coltura cellulare a temperatura ambiente per un'ora per ridurre al minimo gli effetti sui bordi. Quindi inserirlo nell'incubatore con anidride carbonica al 5% 37 gradi Celsius e umidificato. Dopo l'incubazione notturna, esaminare le cellule al microscopio per verificare la loro morfologia e il livello di pigmentazione prima di cambiare il supporto.
Nei giorni di esame successivi, assicurarsi che le cellule siano confluenti con una caratteristica morfologia simile al ciottolo e acquisiscano pigmentazione nel tempo. Per garantire l'idratazione della cartuccia del sensore il giorno prima del test, riempire ogni pozzetto della piastra di utilità con 200 microlitri di acqua deionizzata e posizionare la cartuccia del sensore, immersa in acqua sulla piastra di servizio. Conservare circa 20 millilitri della soluzione calibrante durante la notte in un forno umidificato a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica.
Accendere lo strumento respirometrico ad alta risoluzione e avviare il software per consentire allo strumento di stabilizzarsi a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno del test, sostituire l'acqua nella piastra di servizio con un volume uguale di soluzione calibrante riscaldata almeno 45 minuti prima di eseguire il test. Riscaldare 25 millilitri del mezzo di analisi Mito stress test preparato senza rosso fenolo a 37 gradi Celsius e filtrare sotto vuoto il fluido regolato a pH 7,4, utilizzando un'unità filtrante superiore del tubo.
Rimuovere il mezzo RPE umano dalla piastra di coltura cellulare e aggiungere 100 microlitri di terreno di analisi appena preparato. Quindi posizionare la piastra di coltura cellulare in un forno umidificato a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per un'ora prima di iniziare il test. Ogni cartuccia del sensore ha quattro porte di erogazione del reagente per pozzetto per iniettare i composti in esame nei pozzetti delle piastre di coltura cellulare durante il test.
Preparare tre millilitri delle soluzioni farmacologiche Tenex ciascuna, diluendo le scorte di farmaco nei rispettivi mezzi di analisi. Successivamente, pipettare 20 microlitri del materiale di farmaco Tenex nella porta A, 22 microlitri nella porta B e 25 microlitri nella porta C per raggiungere la concentrazione finale specificata del farmaco in ciascun pozzetto. Successivamente, nel software di analisi, aprire la scheda modelli, selezionare Mito stress test e compilare le definizioni di gruppo.
Inserisci dettagli sulla strategia di iniezione per i farmaci da stress test Mito. Quindi inserire i dettagli sui diversi gruppi sperimentali nel test per il controllo o il trattamento. Immettere i dettagli sui mezzi di analisi per aggiungere diversi integratori e le loro concentrazioni specifiche ai mezzi di analisi di base.
E infine, aggiungi il tipo di cella. Fare clic sulla scheda successiva e quindi su Mappa piastra per assegnare diversi gruppi in esame alla loro posizione specifica sulla piastra a 96 pozzi. Al termine della mappa delle piastre, fare clic sulla scheda del protocollo per rivedere il protocollo dello strumento per il protocollo di stress test Mito predefinito.
Quindi fare clic su esegui il test e inserire la cartuccia del sensore, immersa nella soluzione calibrante nella piastra di utilità per la calibrazione. Questo processo richiede circa 25 minuti e ogni biosensore viene calibrato in modo indipendente, in base all'uscita del sensore misurata nella soluzione calibrante di pH e concentrazione di ossigeno noti. Al termine della calibrazione, rimuovere la piastra di utilità e inserire la piastra di coltura cellulare.
Dopo la misurazione di base, lo strumento inietta automaticamente la soluzione farmacologica Port A in ciascun pozzetto che segue tre cicli di miscelazione e misurazione, tre minuti ciascuno. Lo stesso schema si verifica dopo ogni successiva iniezione di farmaco nelle altre porte. Una volta completata l'esecuzione, rimuovere la piastra di coltura cellulare e la cartuccia del sensore.
Ai fini del controllo qualità, assicurarsi che tutte le porte del farmaco e la cartuccia del sensore siano state iniettate esaminando le porte per non residui residui di farmaco. Successivamente, esaminare le cellule nella micropiastra di coltura cellulare al microscopio per garantire il monostrato confluente di cellule. Quindi scartare il mezzo di analisi e sostituirlo con 60 microlitri di un tampone di lisi x in ciascun pozzetto.
Avvolgere i bordi della piastra in parafilm per evitare l'evaporazione e metterla in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per aiutare nella lisi cellulare durante la notte prima della quantificazione del contenuto proteico, utilizzando il test BCA. Per analisi dei dati, normalizzare tutti i dati dividendo il tasso di consumo di ossigeno o OCR e il tasso di acidificazione extracellulare o i valori ECAR per i microgrammi di proteine in ciascun pozzetto. Quindi esportare il generatore di report di stress test Mito, che utilizza macro di Excel per calcolare automaticamente i parametri dello stress test Mito utilizzando il software di analisi dei dati.
Seguendo gli stessi passaggi dimostrati per lo stress test Mito, è possibile eseguire lo stress test glicolitico, ad eccezione dei mezzi di analisi e delle iniezioni di farmaci che sono diversi, come mostrato nella tabella uno e nella tabella due. Lo strumento misura simultaneamente sia l'OCR che l'ECAR per ogni corsa. Per lo stress test Mito, i calcoli perimetrali si basano sulle letture OCAR, mentre per lo stress test glicolitico, i calcoli dei parametri si basano sulle letture ECAR.
Ecco una curva OCR generata dall'esecuzione dello stress test Mito su cellule RPE umane primarie. I calcoli dei parametri della prova di stress Mito vengono visualizzati come grafici a barre. Allo stesso modo, questa è la curva ECAR, generata dall'esecuzione dello stress test glicolitico su cellule RPE umane primarie e i calcoli sono mostrati come grafici a barre.
Per ottimizzare l'iniezione del farmaco porta B per lo stress test Mito, è stata confrontata l'efficacia di due agenti disaccoppianti nell'aumentare l'OCR nelle cellule RPE umane primarie. BAM15 è risultato essere superiore a FCCP nel migliorare la capacità respiratoria mitocondriale, come si vede dalla respirazione massima significativamente più alta e dalla capacità respiratoria di riserva con BAM15, rispetto alla FCCP. È importante ricordarsi di idratare la cartuccia del sensore il giorno prima di eseguire il test.
Questa tecnica consente ai ricercatori di caratterizzare meglio i profili bioenergetici delle cellule RPE e capire come le cellule RPE mostrano flessibilità metabolica in risposta a diversi stimoli patogeni.
