El alto volumen de información biológica obtenida del análisis de imágenes de códigos de barras multiplex permite a los científicos comprender mejor el microambiente tumoral y la distribución especial dentro de las células tumorales. La principal ventaja de este método es que nos da información mucho más detallada de la misma muestra de tejido con la posibilidad de hacer un fenotipado más profundo de células individuales. Este método permitió paneles personalizables para estudiar el microambiente tumoral para descubrir potencialmente biomarcadores predictivos en el tejido canceroso para usar como nuevo tratamiento objetivo.
Para comenzar la tinción de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos, remoje los resbalones de cubierta en solución de poli-L-lisina al 0,1% durante 24 horas, a temperatura ambiente para prepararlos para la colocación y adherencia del tejido. Después de drenar la solución de poli-L-lisina, lave los cubreobjetos con agua ultrapura durante 30 segundos. Después del lavado, retire los resbalones de la cubierta del agua ultrapura y colóquelos sobre una toalla sin pelusa para que se sequen durante la noche.
Coloque secciones de 5 micras de espesor del tejido de interés en el centro de un cubreobjetos cargado con poli-L-lisina y déjelas secar durante la noche. Precaliente un portapapeles en un horno a 60 grados centígrados, durante la noche. Coloque el cubreobjetos que contiene secciones de tejido en el soporte precalentado.
Después de hornearlo a 60 grados centígrados durante 30 minutos, verifique que la parafina se haya derretido del tejido. Coloque rápidamente el portaobjetos que contiene la muestra secuencialmente, en una serie de soluciones. Finalmente, coloque el portaobjetos en agua ultrapura tratada con DEPC durante dos rondas de cinco minutos cada una.
Prepare una cámara de humedad colocando una toalla de papel empapada en agua en el fondo de una caja de punta de pipeta vacía. Llene una olla a presión con agua, suficiente para cubrir la mitad de la altura de un vaso de precipitados de 50 mililitros. Coloque 5 mililitros de metanol por muestra en un vaso de precipitados a 4 grados centígrados.
Diluir el volumen requerido de tampón AR9 a 1X con pirocarbonato de dietilo o agua ultrapura tratada con DEPC. A continuación, llene un vaso de precipitados de vidrio de 50 mililitros con aproximadamente 40 mililitros del tampón AR9 diluido. Sumerja la muestra en el portaobjetos del vaso de precipitados y cubra completamente el vaso de precipitados con papel de aluminio.
Coloque el vaso de precipitados cubierto de papel de aluminio en la olla a presión llena de agua y cocine a aproximadamente 15 PSI durante 20 minutos. Luego retire el vaso de precipitados y desenvuelva cuidadosamente el papel de aluminio. Deje que el vaso de precipitados se enfríe a temperatura ambiente durante unos 10 minutos.
Retire el soporte de la cubierta del amortiguador 1X AR9. Incubar dos veces en agua ultrapura tratada con DEPC durante dos minutos. Mientras tanto, recupere el tampón de hidratación, el diluyente de anticuerpos y las soluciones de bloqueo N, G, J y S del kit de tinción de imágenes multiplexadas.
Coloque la muestra de la cubierta en 5 mililitros del tampón de hidratación dos veces, durante dos minutos cada una. Luego coloque la muestra de la cubierta en 5 mililitros del bloque diluyente de anticuerpos de imágenes multiplexadas e incube durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, prepare el cóctel de anticuerpos.
Después de la incubación, coloque el cubreobjetos en la cámara de humedad previamente preparada. Pipetear 190 microlitros del cóctel de anticuerpos sobre la muestra de la cubierta e incubar a temperatura ambiente durante tres horas. A continuación, lave la muestra dos veces, cada una con 5 mililitros del bloque diluyente de anticuerpos multiplexados por imágenes durante dos minutos.
Para fijar los anticuerpos unidos al tejido, incubar los cubares de cubierta durante 10 minutos en formaldehído al 16% diluido al 1,6% con solución de almacenamiento, y lavarlos tres veces con PBS. Después de incubar, la cubierta se desliza durante cinco minutos en metanol, enfríe previamente a 4 grados centígrados. Después del lavado, incubar los resbalones de cubierta nuevamente durante 20 minutos, en 5 mililitros del reactivo fijador diluido con PBS, y lavarlos tres veces con PBS antes de almacenarlos.
Prepare la mezcla maestra del reportero siguiendo la composición mencionada en el texto. Llene un pozo en una placa de 96 pocillos con 245 microlitros de una solución que contenga la mezcla maestra reportera y los fluoróforos con código de barras específicos para ese ciclo experimental. La figura muestra una configuración de placa reportera utilizada aquí para un panel de carcinoma.
Para proteger los fluoróforos con código de barras, adhiera una cubierta de placa de aluminio sobre la placa reportera de 96 pocillos y coloque la placa dentro del instrumento de imágenes multiplexado. Calibre el foco de la imagen utilizando el canal DAPI colocando un portamuestras en la etapa del microscopio y pipeteando manualmente 700 microlitros de una titulación 1:1500 de una solución de tinción nuclear en el tejido. Para preparar el instrumento de imágenes multiplexadas, diluya el tampón de imágenes multiplexado 10X a 1X con agua ultrapura tratada con DEPC y llene las botellas de reactivos con soluciones o solventes apropiados.
Establezca todos los parámetros del microscopio y seleccione las regiones de interés en la hoja de cubierta de la muestra que se va a fotografiar. Introduzca el diseño experimental en el software del gestor de instrumentos. Haga clic en el botón Experimento del software de control y, en la ventana Configuración y administración del experimento, haga clic en el botón Nueva plantilla.
Escriba el nombre del proyecto en el espacio situado junto al botón Proyecto e introduzca el número total de ciclos. Haga clic en el botón Asignación de canales, escriba la información de cada ciclo en las columnas, como el ciclo correcto, los números de pozo, los lugares de la pila Z, el nombre del marcador, la clase y el tiempo de exposición para cada ciclo. A continuación, inicie el experimento haciendo clic en Iniciar experimento y guarde el experimento.
Haga clic en el icono QuPath en la computadora y abra el software. Arrastre el archivo qptiff a la ventana del visor. Haga clic en el botón Brillo y contraste para abrir la ventana Contraste de brillo.
Marque o desmarque el marcador en la columna seleccionada para mostrar u ocultar la señal del marcador. Haga clic en el botón de zoom para ajustar para acercar o alejar el área de interés. Cuando se visualizaron utilizando software de análisis de imágenes, las imágenes compuestas mostraron todos los marcadores o marcadores seleccionados como se deseaba.
Se reveló la intensidad de la señal, el rango dinámico y la distribución espacial de todos los marcadores. Esta técnica permitió el análisis de los 26 marcadores a nivel subcelular en una sola sección de tejido. Siguiendo el proceso de análisis de imágenes múltiples, mediante enfoques informáticos puede procesar y analizar los datos de células individuales de alta dimensión para inferir información biológica y clínica.
El análisis de imágenes de códigos de barras multiplexación es una metodología poderosa que permite a los científicos perfilar el tejido tumoral y responder a su pregunta de investigación de acuerdo con los marcadores en los paneles.
