小蛋白泛素对蛋白质的转化后修饰参与细胞中的许多事件。本研究为蛋白质泛化分析工具箱提供了原始补充。我们使用浓缩技术和质谱法来揭示深泛素。
我们对源自泛素蛋白的二元肽的分析做了一些改进。其中包括浓缩前的粗肽分馏，以及在轨道中应用更先进的肽碎片设置。总之，这导致泛基的覆盖范围更大。
协议的几个方面很难用语言来描述。可视化某些关键步骤对于能够在不同的实验室中由不同的操作员重复这些分析至关重要。该程序将由卡雷尔·贝兹斯塔罗斯蒂演示，他是我实验室的高级技术人员。
首先为实验准备培养细胞或小鼠脑组织。如果与细胞一起使用，将细胞颗粒从一个150厘米的方形培养板中解碎，在两毫升的冰冷中，50毫升Tris HCL与0.5%的脱氧二甘酸钠。在95摄氏度下将酸盐煮沸5分钟。
然后在4摄氏度下进行10分钟的声波化。如果使用体内小鼠脑组织，在含有100毫摩尔Tris HCL、12毫摩尔钠脱氧二甘酸酯和12毫摩尔钠N-劳罗伊尔斯科盐的冰冷缓冲液中解液。在4摄氏度下对酸盐进行10分钟的声波化。
然后在95摄氏度下煮5分钟。接下来，使用热量测量吸收度 BCA 蛋白质测定试剂盒对总蛋白质量进行定量，该试剂盒至少应为几毫克，用于成功的二肽免疫沉淀。对于SILAC实验，根据蛋白质总量，将轻质和重标记蛋白以一对一的比例混合。
在50摄氏度下，使用5毫摩尔DTT减少所有蛋白质30分钟。然后，在黑暗中用10毫摩尔碘乙酰胺来炼金，用15分钟。然后用Lys-C进行4小时的蛋白质消化。
在30摄氏度或室温下过夜消化。第二天，将样品分成两毫升Eppendorf管，将TFA加入消化样品，最终浓度为0.5%，在10000倍G下离心，10分钟沉淀并去除所有洗涤剂。收集含有上能的肽，以便随后进行分馏。
使用高 pH 反向相 C18 色谱对尝试肽进行分馏。准备一个空的六毫升柱盒，里面装满了 0.5 克固定相材料，用于约 10 毫克蛋白质消化。将肽加载到准备好的柱上，用大约 10 卷 0.1%TFA 洗涤，然后用 10 卷水清洗。
使用10列体积10毫摩尔铵的10个多肽将肽分成三个分数，分别具有7、13.5%和50%的乙酰酸。然后，点燃所有分数。一批与蛋白质 A agarose 珠浆结合的泛素残余图案抗体被分成六个相等的分数。
根据手稿方向溶解三个肽部分，然后旋转碎片。将三个分数的超自然剂添加到珠浆中，同时将其他三个分数留在冰上。并在旋转装置上孵育两小时，在4摄氏度下。
然后，旋转珠子。将上一液转移到新鲜批次的珠子上。并重复孵育与剩余的三个珠浆分数。
存储超生剂以进行后续全局蛋白质组分析。将珠子转移到配备 GFF 滤清器插头的 200 微升移液器尖端。将尖端放入装有离心尖端适配器的1.5毫升管中，用200微升的冰冷 IAP 缓冲液洗三次珠子，然后用冰冷纯净水洗三次。
在洗涤之间以 200 次 G 向下旋转柱子两分钟，确保不要让柱子干涸。最后洗涤后，用两个周期洗两个周期，在 50 微升 0.15% TFA。用 C18 级尖端对肽进行脱盐，然后用真空离心干燥。
在与纳米流LC系统耦合的敏感质谱仪上执行LC-MS/MS实验。柱子按照稿稿指示设置，保持在50摄氏度。在数据相关采集模式下操作质谱仪。
以高分辨率收集 MS1 质谱，自动增益控制目标设置为 4E5，最长喷射时间为 50 毫秒。在最激烈的第一模式下执行质谱分析，使用总循环时间为三秒的最高速度方法。然后以最不激烈的第一模式进行第二轮DDA MS分析，从而确保低丰度肽的最佳检测。
根据前体离子的电荷状态和单同位素峰分配过滤前体离子。并动态排除先前询问的前体 60 秒。分离肽前体，四极性质量过滤器设置为1.6汤姆森的宽度。
然后收集MS2光谱在离子陷阱在自动增益控制7E3与最大注入时间50毫秒和HCD碰撞能量30%分析质谱原始文件使用适当的搜索引擎，如基于仙女座搜索引擎的免费提供的MaxQuant软件套件。打开 MaxQuant 并选择相应的原始数据文件。设置处理器数量并单击组特定参数选项卡。
选择消化，并允许三个错过的裂解。然后选择修改并添加到变量修改中。选择全局参数选项卡并添加正确的蛋白质序列数据库。
将其他设置保留为默认设置，然后按"开始"执行数据库搜索。对于SILAC实验文件的定量分析，将多重性设置为两个，并选择重氨基酸标签。搜索完成后，将文本文件导入 Perseus。
该协议用于通过检测纳米流LC-MS/MS的二元肽，识别培养细胞和体内物质蛋白质中的泛化位点。对现有协议进行了若干改进，导致检测到的二肽数量增加。在免疫沉淀之前，对三个分数进行了粗略的分馏。
其中一个分数含有泛素自己的K48改性二元肽，其特点是LC色谱图中具有宽峰。此外，对肽碎片制度进行了调整，将LC-MS运行与数据分析过程中最高的第一和最低的第一碎片制度相结合，从而产生了4000多个额外独特的二维肽。从用蛋白酶体抑制剂治疗的一个 HeLa 细胞样本中，可以常规地识别出超过 23，000 种二元肽。
在三个生物复制屏里识别的所有二肽中，超过9000种存在于所有三个复制的屏幕中，而超过1.7万种存在于至少三个复制的两个中。肽鉴定的数量高度取决于输入材料的数量。根据起始材料，可以预期大约数量的已识别二元肽，但这些数字只是估计，也将取决于使用的质谱仪的类型。
在执行此协议时，以前基于质谱法的蛋白质组学方法的经验以及处理和分析微小样本量肯定有利。MaxQuant 软件可以由任何其他数据库搜索算法替换。也可以使用不同类型的质谱仪。
肽鉴定的结果可能略有不同，但这是典型的任何质谱学为基础的蛋白质组学测定。泛素在中化蛋白降解过程中很重要，但在细胞的许多其他过程中也起着一定的作用。对泛素作为翻译后修改的更深入的了解对于更好地了解其功能至关重要。
