Bu modifiye ELISA protokolü, insan plazmasında CGRP'nin saflaştırılmasına ve doğru bir şekilde ölçülmesine izin verir. Gerekli doğrulama deneylerinden geçmiştir ve gelecekteki niceleme metodolojilerini standartlaştırmaya hizmet edebilir. Bu protokol, önemli proteaz bozunmasından önce numune işlemeyi, katı faz ekstraksiyonu yoluyla saflaştırmayı ve mikrotitre plakalarına bloke edici tampon uygulanarak spesifik olmayan bağlanmanın sınırlandırılmasını dahil etmenin avantajlarını sunar.
CGRP, migrenin patofizyolojisinde cezalandırıcı bir rol oynar ve belki de biyobelirteç statüsü için bir adaydır. Ayrıca kardiyolojik, dermatolojik, viral ve hatta COVID-19 ile ilişkili hastalık süreçlerinde de rol oynamıştır. Başlamak için, standart venipunktur yöntemleriyle antekübital damardan 5 mililitre tam kanı 6 mililitrelik bir vakuminer EDTA tüpüne toplayın.
Hedef peptidin parçalanmasını engellemek için, 0.5 mililitre aprotinin rekabetçi serin proteaz inhibitörü ekleyin. Tüpü 10 kez ters çevirin ve bir sonraki adıma kadar buz üzerinde saklayın. Daha sonra tüpü 600 4g'de 4 santigrat derecede dört dakika boyunca santrifüj edin.
Plazma fraksiyonunu 2 mililitrelik yuvarlak tabanlı steril kriyo şişesine aktarın. Kriyo şişesini derhal eksi 80 santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın. Plazma numunesini çıkarmak için, 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpünün içine bir ekstraksiyon kartuşu yerleştirin.
Etkinleştirmek için kartuştan 5 mililitre% 100 metanol, ardından 10 mililitre ultra saf su geçirin. Sıvı, yerçekimi tahrikli akış ile kartuştan geçerken tüpte toplanacaktır. Kartuşu yutmasını önlemek için biriken fazla sıvıyı atın ve deney sırasında kurumadığından emin olun.
250 mikrolitre plazmayı 750 mikrolitre% 4 asetik asit içinde seyreltin ve yavaşça kartuştan geçirin. Ardından kartuşu 10 mililitre asetik asitle yıkayın. Fazla sıvı çıkarıldıktan sonra, kartuşu yeni bir 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın.
Kalsitonin geni ile ilgili peptit veya CGRP'yi ortaya çıkarmak için 3 mililitre metanol asetik asit çözeltisi hazırlayın. 1 mililitresini kartuştan geçirin ve her bir elüsyon arasında 25 dakika bekleyin. Son elüsyondan sonra, tüp 3 mililitre toplam elüant içerir.
Elüantın 1 mililitresini 1,7 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve elüantı yerleştirmek için bir saniye boyunca mini bir santrifüjde döndürün. Daha sonra numuneyi 1.400 RPM ve 4 santigrat derecede bir vakum santrifüjünde kurutun. Tahlilden hemen önce, kurutulmuş numuneyi çözülmüş enzim immünoassay veya ÇED tamponu ile yeniden oluşturun.
Plaka blokajı için, her bir kuyucuğa 250 mikrolitre TBS balık jelatin bloke edici tampon ekleyin. Plakanın üzerine bir kapak tabakası yerleştirin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kapak tabakasını çıkarın ve ters çevirerek plakayı boşaltın.
Ardından, herhangi bir iz sıvıyı atmak için plakayı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve laminer akış başlığında 10 dakika kurutun. Plaka gözle görülür şekilde kuruduktan sonra, silika jel kurutucu poşetli kavrama sızdırmaz bir folyo torbaya yerleştirin. 24 saat boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Tahlil yapmadan önce, tüm numuneleri ve hazırlanan reaktifleri oda sıcaklığında çözün. Blok plakanın kuyucuklarını durulamak için 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve 30 saniye bekletin. Ardından yıkama tamponunu atın ve durulamayı beş kez tekrarlayın.
Son durulamadan sonra, plakayı daha önce gösterildiği gibi lekeleyin. Ardından, özel iki spesifik olmayan bağlama veya NSB kuyusuna 100 mikrolitre ÇED tamponu dağıtın. CGRP standartlarının 100 mikrolitresini, ardından yeniden yapılandırılmış numuneyi ve kalite kontrolünü uygun kuyucuklara kopya halinde ekleyin.
Boş kuyucuklar hariç her bir kuyucuğa 100 mikrolitre CGRP izleyici ekleyin. Son olarak, plakayı şeffaf bir kapak tabakası kullanarak kapatın, numunelerin ve reaktiflerin buharlaşmamasını sağlayın ve plakayı 4 santigrat derecede 16 ila 20 saat boyunca inkübe edin. Kuluçka süresi sona erdiğinde, Ellman'ın reaktifini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
Plaka döküldükten sonra, her bir kuyucuğu daha önce gösterildiği gibi üç kez yıkayın. Son durulamadan sonra, plakayı iki dakika boyunca 120 RPM'de çalkalayın. Yine, plakayı üç kez durulayın ve kurutun.
Sıvı kuyucuklardan gözle görülür şekilde çıkarılana kadar ters çevrilmiş plakaya dokunun. Ardından, boş kuyucuklar hariç her bir kuyucuğa 200 mikrolitre Ellman reaktifi ekleyin. Plaka kaplandıktan sonra, ışığa maruz kalmayı önlemek için alüminyum folyoya sarın ve emilimi kaydetmeden önce karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.
Bu çalışma, blokaj adımının eklenmesiyle, her CGRP spike örneğindeki iyileşme oranlarının kabul edilebilir aralıkta olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, bloke edici adım hariç tutulduğunda, spesifik olmayan bağlanma, iyileşme oranlarının% 125'lik üst sınırı aşmasıyla sonuçlandıCGRP bozulmasını sınırlamak için toplandıktan kısa bir süre sonra kan örneklerini tutmak için aprotinin eklenmesi önemlidir. Ek olarak, spesifik olmayan bağlanmayı daha da azaltmak için bloke edici tampon, ELISA'dan önce mikrotiter plakasına eklenmelidir.
Bu nedenle, bu protokol, migren ve vestibüler migreni olan plazma hastalarında kontrollere karşı CGRP seviyelerini ölçerek vestibüler migren için bir biyobelirteç olarak CGRP'nin adaylığını araştırmak için kullanılabilir.
