Этот модифицированный протокол ИФА позволяет проводить очистку и точное количественное определение CGRP в плазме человека. Он подвергся необходимым проверочным экспериментам и может служить для стандартизации будущих методологий количественной оценки. Этот протокол предлагает преимущества, заключающиеся в том, что он включает обработку образцов перед значительной деградацией протеазы, очистку с помощью твердофазной экстракции и ограничение неспецифического связывания путем нанесения блокирующего буфера на микротитровальные планшеты.
CGRP играет карательную роль в патофизиологии мигрени и, возможно, является кандидатом на статус биомаркера. Он также участвует в кардиологических, дерматологических, вирусных и даже связанных с COVID-19 заболеваниях. Для начала соберите 5 миллилитров цельной крови из антекубитальной вены с помощью стандартных методов венепункции в 6-миллилитровую вакуумную пробирку ЭДТА.
Чтобы блокировать лизис пептида-мишени, добавьте 0,5 миллилитра апротинина, конкурентного ингибитора сериновой протеазы. Переверните тюбик 10 раз и храните его на льду до следующего шага. Затем центрифугируйте пробирку при 600 4g в течение четырех минут при 4 градусах Цельсия.
И переложите фракцию плазмы в 2-миллилитровый стерильный криофлакон с круглым дном. Немедленно храните криофлакон при температуре минус 80 градусов по Цельсию до двух недель. Для извлечения образца плазмы поместите экстракционный картридж в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.
Пропустите 5 миллилитров 100% метанола, затем 10 миллилитров сверхчистой воды через картридж, чтобы активировать его. Жидкость будет собираться в трубку, когда она проходит через картридж под действием силы тяжести. Утилизируйте скопившуюся лишнюю жидкость, чтобы она не поглотила картридж и не высохла во время эксперимента.
Разбавьте 250 микролитров плазмы в 750 микролитрах 4%-ной уксусной кислоты и медленно пропустите ее через картридж. Затем промойте картридж 10 миллилитрами уксусной кислоты. После удаления лишней жидкости переложите картридж в новую коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.
Приготовьте 3 миллилитра раствора метанолуксусной кислоты, чтобы разбавить пептид, связанный с геном кальцитонина, или CGRP. Пропустите 1 миллилитр через картридж и подождите 25 минут между каждым вымыванием. После последнего элюирования пробирка содержит 3 миллилитра общего элюанта.
Перелейте 1 миллилитр элюанта в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитра и вращайте его в мини-центрифуге в течение одной секунды, чтобы элюант отстоялся. Затем высушите образец в вакуумной центрифуге при 1,400 об/мин и 4 градусах Цельсия. Непосредственно перед анализом восстановите высушенный образец с помощью размороженного иммуноферментного анализа или буфера ИФА.
Для блокировки пластин добавьте в каждую лунку 250 микролитров буфера для блокировки рыбного желатина TBS. Накройте тарелку накрытым листом и выдерживайте два часа при комнатной температуре. После инкубации снимите покровный лист и опорожните тарелку, перевернув ее.
Затем промокните тарелку на бумажном полотенце, чтобы удалить остатки жидкости, и высушите ее в вытяжке с ламинарным потоком в течение 10 минут. Как только пластина заметно высохнет, поместите ее в герметичный пакет из фольги с пакетиком с осушителем силикагеля. Храните его при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 24 часов.
Перед проведением анализа разморозьте все образцы и приготовленные реактивы при комнатной температуре. Чтобы промыть лунки блочной пластины, добавьте 300 микролитров буфера для промывки и оставьте на 30 секунд. Затем выбросьте буфер для стирки и повторите полоскание пять раз.
После последнего полоскания промокните тарелку, как было продемонстрировано ранее. Затем распределите 100 микролитров буфера EIA в две специальные лунки для неспецифического связывания или NSB. Добавьте 100 микролитров стандартов CGRP, а затем восстановленную пробу и контроль качества в двух экземплярах в соответствующие лунки.
Добавьте 100 микролитров индикатора CGRP в каждую лунку, кроме пустых лунок. Наконец, запечатайте пластину прозрачным покровным листом, следя за тем, чтобы образцы и реагенты не испарялись, и инкубируйте пластину в течение 16-20 часов при температуре 4 градуса Цельсия. По окончании инкубационного периода приготовьте реагент Эллмана в соответствии с инструкциями производителя.
После того, как тарелка декантируется, промойте каждую из них три раза, как было показано ранее. После последнего полоскания встряхните тарелку при 120 об/мин в течение двух минут. Снова трижды промойте тарелку и промокните ее насухо.
Постукивайте по перевернутой пластине до тех пор, пока жидкость не будет заметно удалена из лунок. Затем добавьте 200 микролитров реагента Эллмана в каждую лунку, кроме глухих лунок. После того, как пластина покрыта, заверните ее в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить воздействие света, и инкубируйте ее в темноте при комнатной температуре в течение одного часа, прежде чем записывать поглощение.
Настоящее исследование показало, что при добавлении этапа блокировки скорости восстановления в каждом образце спайка CGRP находились в пределах допустимого диапазона. Однако, когда стадия блокировки была исключена, неспецифическое связывание приводило к скорости восстановления, превышающей верхний предел 125%Важно добавить апротинин для хранения образцов крови вскоре после сбора, чтобы ограничить деградацию CGRP. Кроме того, блокирующий буфер следует добавлять в микротитровальную пластину перед ИФА для дальнейшего снижения неспецифического связывания.
Таким образом, этот протокол может быть использован для изучения кандидатуры CGRP в качестве биомаркера вестибулярной мигрени путем количественной оценки уровней CGRP у пациентов с мигренью и вестибулярной мигренью в плазме по сравнению с контрольной группой.
