细胞外基质或ECM数字水凝胶微粒可用作支架制造的构建块。该协议展示了明胶甲基丙烯酰或GelMA水凝胶微粒的制造，纯化，冻干，照片组装和3D生物打印。GelMA是一种光化学，可交联，基于蛋白质的生物聚合物，含有细胞粘合剂和可生物降解的部分，已被广泛用作细胞响应和指导性的生物材料。
与传统的散装水凝胶相比，GelMA颗粒水凝胶支架是微孔的，可以根据构建块尺寸进行快速细胞浸润。GelMA颗粒水凝胶支架可能为在廉价平台和再生工程上对厚组织，器官和疾病的3D生物打印开辟新的机会。首先，将 10 毫克 LAP 加入 10 毫升 DPBS 中以制备 0.1% 光引发剂溶液。
用铝箔包裹溶液，使其免受光照，并贴上标签。接下来，将所需量的GelMA溶解在光引发剂溶液中。将铝箔包裹的溶液放入 37 摄氏度的烤箱中一小时，以获得澄清的溶液。
为了制备油相，在工程流体中制备2%生物相容的表面活性剂溶液。将 Tygon 管插入 PDMS 设备的入口和出口，然后将 25 号钝针插入 Tygon 管的另一端用于入口。将设备放在显微镜下，并使用吹风机或空间加热器将环境保持在约40摄氏度的温度。
将水溶液和油溶液装入连接到设备的单独注射器中。以每分钟160微升的流速启动油相注射泵。油充满通道后，以每分钟 80 微升的速度启动水相。
在显微镜下检查液滴的形成。将液滴收集在容器中，并通过光学显微镜成像在成像室中对其进行评估。将液滴保持在4摄氏度过夜，同时保护它们免受光照，以启动GelMA微凝胶的物理交联并将液滴转化为稳定的微凝胶。
为了实施微工程乳液到粉末MEtoP方法，使用耐热微量离心管或冷冻管收集工程流体中的物理交联微凝胶。用实验室擦拭布和胶带密封开口管。将物理交联的微凝胶在液氮中深度冷冻10分钟以进行冻干。
冻干后，将获得固体粉末。在冻干粉末中加入一毫升冷却的0.1%光引发剂溶液，在4摄氏度下制成微凝胶悬浮液。将涡旋混合物以3， 000g离心15秒。
弃去上清液后，使用外置活塞式移液器将包装好的微凝胶悬浮液转移到模具中，并将其暴露在400纳米波长的光下，强度为每平方厘米15毫瓦60秒，形成颗粒状水凝胶支架或GHS。对于400微凝胶悬浮液，向物理交联的GelMA微凝胶中加入等量的冰冷PFO溶液，20%的工程流体。然后将涡旋混合物以300g离心15秒，并通过移液从GelMA微凝胶中除去油相。
然后在微凝胶悬浮液中加入400微升冰冷的0.1%光引发剂溶液。将涡旋溶液以300g离心15秒后，弃去油。重复光引发剂溶液加入和离心的步骤，但这次以3， 000g离心，并弃去填充的GelMA微凝胶的上清液。
将包装好的GelMA微凝胶转移到模具中，然后进行光照以形成GHS。将100毫克纳米片粉加入3毫升冰冷的超纯水中，形成3.33%的纳米颗粒分散体。在四摄氏度的冰箱内剧烈涡旋分散体15分钟，以去除聚集的纳米颗粒。
适当剥离的纳米颗粒产生清晰的分散体。将 50 毫克 LAP 溶解在 5 毫升冰冷的超纯水中，制备 1% 光引发剂储备溶液。然后将333微升1%光引发剂溶液加入剥落的纳米颗粒分散体中，并将其包裹在铝箔中以防止环境光。
涡旋混合物一分钟以混合纳米颗粒分散体和光引发剂。将冰冷的PFO（20%工程流体）以一比一的体积比添加到物理交联的GelMA微凝胶中。将涡旋混合物以300g离心15秒后，丢弃含有表面活性剂的油相。
将冰冷的、补充LAP的纳米颗粒分散体添加到洗涤的GelMA微凝胶中。在3， 000g离心15秒后，弃去底部剩余的油和上清液分散液。将悬浮液储存在四摄氏度，同时使用铝箔保护其避光一天，以产生产品GelMA纳米工程颗粒生物墨水或NGB。
第二天，将NGB装入三毫升注射器中。用盖子和封口膜密封装载的注射器，并以200g进行脉冲离心以除去滞留的空气。使用母-母鲁尔锁连接器将生物墨水转移到三毫升墨盒中。
再次以 200g 的速度短暂离心滤芯以去除滞留的空气，并在使用前将 NGB 保持在 4 摄氏度。接下来，将制备好的鼠成纤维细胞悬液装入三毫升注射器中。使用母-母鲁尔锁连接器耦合NGB和细胞加载注射器，并通过来回推动40次轻轻混合内容物。
通过将喷嘴装入三毫升打印头，使用带有标准锥形喷嘴的适当生物打印机打印NGB或含有细胞的NGB。保持打印床温度低于10摄氏度，并优化速度和背压等参数。选择所需的 gcode 或 STL 文件。
然后为配备标准锥形喷嘴的气动三毫升注射器选择基材和喷嘴类型。使用设备指南校准生物打印机，并开始打印以获得3D结构。MEtoP技术通过低压冷冻干燥生产可重悬的干燥微凝胶粉末，同时保护微凝胶免受聚集和严重变形。
SEM图像显示，与传统冻干观察到的聚集相比，使用该技术的干燥GelMA微粒在冻干后保持其球形。使用高分子量荧光染料对GelMA，GHS和NGB的微孔表征显示了相互连接的微尺度空隙空间。此外，使用自定义编写的MATLAB脚本评估的荧光图像检测到孔隙。
空隙分数和中位数孔等效直径测量显示没有显着差异，证明了使用NGB的3D打印支架中微尺度孔的可用性和互连性。通过悬挂丝长度测量，NGB支架优于紧密和松散包装的GelMA微凝胶，表明NGB的长度大于填充微凝胶。松散包装的微凝胶不会产生细丝。
一个空心圆柱体被3D打印，整个结构暴露在光线下进行光交联。打印结构被物理固定以显示形状、保真度和结构完整性。如果支架用于生物评估，例如，在充满细胞的生物打印中，请记住在特定条件下在生物安全柜下执行所有步骤。
我们希望将颗粒水凝胶支架作为生物医学中新兴的生物材料平台的使用去市场化。
