מטריצה חוץ-תאית או מיקרו-חלקיקי הידרוג'ל נומריים ECM עשויים לשמש כאבני הבניין לייצור פיגומים. פרוטוקול זה מדגים ייצור, טיהור, ליופיליזציה, הרכבת תמונות והדפסה ביולוגית תלת-ממדית של חלקיקי ג'לטין מתקרילויל או ג'ל הידרוג'ל. GelMA הוא ביופולימר פוטוכימי, ניתן להצלבה, מבוסס חלבון המכיל דבק תאים ו moieties מתכלה אשר נמצא בשימוש נרחב כחומר ביולוגי מגיב לתאים ומלמד.
בהשוואה להידרוג'ל בתפזורת קונבנציונאלי, פיגומי הידרוג'ל גרגיריים של GelMA הם מיקרו-נקבוביים, ומאפשרים חדירה מהירה של תאים שניתן להתאים לפי גודל אבן הבניין. פיגומי הידרוג'ל גרעיניים של GelMA עשויים לפתוח הזדמנויות חדשות להדפסה ביולוגית תלת-ממדית של רקמות עבות, איברים ומחלות על פלטפורמות זולות והנדסה רגנרטיבית. כדי להתחיל, הוסף 10 מיליגרם של LAP ל -10 מיליליטר של DPBS כדי להכין פתרון 0.1% photoinitiator.
הגן על התמיסה מפני אור על ידי עטיפתה ברדיד אלומיניום, ותייג אותה. לאחר מכן, להמיס את הכמות הרצויה של GelMA בתמיסת photoinitiator. הכניסו את התמיסה עטופה ברדיד אלומיניום לתנור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לקבלת תמיסה ברורה.
כדי להכין את שלב השמן, הכינו תמיסת פעילי שטח 2% תואמת ביולוגית בנוזל ההנדסי. הכנס את צינורות Tygon לכניסות ולשקעים של התקן PDMS, ולאחר מכן הכנס מחט קהה של 25 מד בקצה השני של צינורות Tygon עבור כניסות. הניחו את המכשיר מתחת למיקרוסקופ, ושמרו על חום הסביבה בטמפרטורה של כ-40 מעלות צלזיוס באמצעות מייבש שיער או מחמם חלל.
טען את תמיסות המים והשמן במזרקים נפרדים המחוברים למכשיר. הפעל את משאבת המזרק לשלב השמן בקצב זרימה של 160 מיקרוליטר לדקה. לאחר שמן ממלא את התעלה, להתחיל את השלב המימי ב 80 מיקרוליטר לדקה.
בדוק את היווצרות הטיפות מתחת למיקרוסקופ. אספו את הטיפות במיכל, והעריכו אותן בתא ההדמיה על ידי הדמיה במיקרוסקופ אופטי. שמור את הטיפות על ארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה תוך הגנה עליהן מפני אור כדי להתחיל את הקישור הפיזי של מיקרוג'ל GelMA ולהמיר את הטיפות למיקרוג'לים יציבים.
כדי ליישם את שיטת MEtoP של תחליב לאבקה מהונדסים, אספו את המיקרו-ג'לים המוצלבים פיזית בנוזל ההנדסי באמצעות צינורות מיקרוצנטריפוגות או קריובלים עמידים תרמית. אטמו את הצינור הפתוח בעזרת מגבון מעבדה וסרט הדבקה. הקפיאו עמוק את המיקרו-ג'לים המוצלבים פיזית בחנקן נוזלי למשך 10 דקות כדי להמשיך בליופיליזציה.
לאחר ליופיליזציה, אבקה מוצקה יתקבל. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת פוטו-איניוזם מקוררת של 0.1% בארבע מעלות צלזיוס לאבקה הליופילית כדי ליצור תרחיפים של מיקרוג'ל. צנטריפוגה את התערובת מערבולת ב 3, 000 גרם במשך 15 שניות.
לאחר השלכת הסופרנטנט, מעבירים את מתלה המיקרוג'ל הארוז לתבנית באמצעות פיפטה בעלת תזוזה חיובית, וחושפים אותו לאור באורך גל של 400 ננומטר בעוצמה של 15 מיליוואט לסמ"ר למשך 60 שניות ליצירת פיגומי הידרוג'ל גרגיריים או GHS. עבור 400 מיקרוליטר של תרחיף מיקרוג'ל, הוסף כמות שווה של תמיסת PFO קרה כקרח, 20% בנוזל הנדסי למיקרוג'לים GelMA מוצלבים פיזית. לאחר מכן צנטריפוגו את תערובת המערבולות במשקל 300 גרם למשך 15 שניות, והסירו את שלב השמן מהמיקרו-ג'לים של GelMA על ידי פיפטציה.
לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של תמיסת פוטו-איניוזם קרה כקרח, 0.1% לתרחיף המיקרוג'ל. לאחר צנטריפוגה של התמיסה המערבולת ב 300 גרם במשך 15 שניות, להשליך את השמן. חזור על השלבים של חיבור פתרון photoinitiator וצנטריפוגה, אבל צנטריפוגה ב 3, 000g הפעם להיפטר supernatant של מיקרוג'ל GelMA ארוז.
מעבירים את מיקרו-ג'לי GelMA הארוזים לתבנית, ולאחר מכן חשיפה לאור ליצירת GHS. הוסיפו 100 מיליגרם של אבקת ננו-טסיות לשלושה מיליליטר מים קרים כקרח וטהורים במיוחד ליצירת פיזור של 3.33% ננו-חלקיקים. מערבבים את הפיזור במרץ בתוך מקרר של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לקלף את הננו-חלקיקים המצטברים.
ננו-חלקיקים שעברו קילוף תקין מניבים פיזור ברור. יש להמיס 50 מיליגרם של LAP בחמישה מיליליטר של מים קרים כקרח וטהורים במיוחד כדי להכין תמיסת מלאי פוטו-אינסטיטומנט של 1%. לאחר מכן הוסף 333 מיקרוליטר של תמיסת 1% פוטו-יוזם לפיזור ננו-חלקיקים מתקלפים, ועטוף אותה ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני האור הסביבתי.
מערבבים את התערובת במשך דקה אחת כדי לערבב את פיזור הננו-חלקיקים ואת הפוטו-יוזם. הוסף PFO קר כקרח, 20% נוזל הנדסי למיקרו-ג'לים GelMA מוצלבים פיזית ביחס נפח של אחד לאחד. לאחר צנטריפוגה של התערובת המעורבת ב-300 גרם למשך 15 שניות, יש להשליך את שלב השמן המכיל את חומר פעילי השטח.
הוסיפו את פיזור הננו-חלקיקים הקר כקרח בתוספת LAP למיקרו-ג'לים השטופים של GelMA. לאחר צנטריפוגה ב 3, 000 גרם במשך 15 שניות, להשליך את השמן שנותר בתחתית ואת פיזור supernatant. אחסנו את המתלה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך הגנה עליו מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום למשך יום אחד כדי להניב את המוצר, ביו-דיו גרעיני גרעיני ננו-מהונדס או NGB.
למחרת, לטעון את NGB לתוך מזרק שלושה מיליליטר. אטמו את המזרק הטעון עם פקק ופרפילם, ובצעו צנטריפוגת פולס במשקל 200 גרם כדי להסיר את האוויר הכלוא. העבר את הדיו הביולוגי למחסנית של שלושה מיליליטר באמצעות מחבר נעילת Luer נקבה-נקבה.
צנטריפוגו את המחסנית לזמן קצר ב-200 גרם שוב כדי להסיר את האוויר הלכוד, ולשמור על ה-NGB בארבע מעלות צלזיוס לפני השימוש. לאחר מכן, לטעון את השעיית תאי פיברובלסט murine מוכן לתוך מזרק שלושה מיליליטר. חברו את מזרקי ה-NGB והמזרקים הטעונים בתאים באמצעות מחבר Luer Lock נקבה-נקבה, וערבבו את התוכן בעדינות על ידי דחיפה קדימה ואחורה 40 פעמים.
הדפס את ה-NGB או NGB עמוס התאים באמצעות מדפסת ביולוגית מתאימה עם פייה חרוטית סטנדרטית על-ידי טעינת הזרבובית לתוך ראש ההדפסה של שלושה מיליליטר. שמור על טמפרטורת מיטת ההדפסה מתחת ל-10 מעלות צלזיוס, ומטב פרמטרים כגון מהירות ולחץ גב. בחר את gcode הרצוי או קובץ STL.
לאחר מכן בחר את המצע ואת סוג הזרבובית עבור מזרק פנאומטי שלושה מיליליטר מצויד זרבובית חרוט סטנדרטי. כייל את המדפסת הביולוגית באמצעות הנחיות ההתקן והתחל להדפיס כדי לקבל את מבני התלת-ממד. טכנולוגיית MEtoP הניבה אבקת מיקרוג'ל מיובשת הניתנת למריחה על ידי ייבוש בהקפאה בלחץ נמוך תוך הגנה על מיקרוג'לים מפני צבירה ועיוותים חמורים.
תמונות SEM הראו כי חלקיקי GelMA המיובשים המשתמשים בטכנולוגיה זו שומרים על צורתם הכדורית לאחר ליופיליזציה בהשוואה לצבירה שנצפתה עם ליופיליזציה קונבנציונלית. אפיון המיקרו-נקבוביות של GelMA, GHS ו-NGB עם צבע פלואורסצנטי בעל משקל מולקולרי גבוה הראה את חללי החלל המיקרוסקולריים המחוברים זה לזה. כמו כן, התמונה הפלואורסצנטית שהוערכה באמצעות סקריפט MATLAB שנכתב בהתאמה אישית זיהתה את הנקבוביות.
מדידות הקוטר של שבר הריק והנקבוביות החציוניות לא הראו הבדל משמעותי המעיד על הזמינות והקישוריות של נקבוביות מיקרוסקליות בפיגומים המודפסים בתלת-ממד באמצעות NGB. העליונות של פיגומים מסוג NGB על פני מיקרו-ג'לים GelMA ארוזים באופן הדוק ורופף על ידי מדידת אורך חוט הלהט התלוי, חשפה כי ל-NGB היה אורך גדול יותר מהמיקרו-ג'לים הארוזים. המיקרו-ג'לים הארוזים באופן רופף לא הניבו חוטים.
גליל חלול הודפס בתלת-ממד, וכל המבנה נחשף לאור לצורך פוטוקרוסלינקינג. המבנה המודפס הוחזק פיזית כדי להראות את הצורה, הנאמנות והשלמות המבנית. אם הפיגום משמש להערכה ביולוגית, למשל, בהדפסה ביולוגית עמוסת תאים, זכרו לבצע את כל השלבים בתנאים מסוימים, תחת ארון הבטיחות הביולוגי.
אנו מקווים לבטל את השיווק של השימוש בפיגומי הידרוג'ל גרגיריים כפלטפורמה ביו-חומרית חדשה בביו-רפואה.
