Внеклеточный матрикс или микрочастицы цифрового гидрогеля ECM могут быть использованы в качестве строительных блоков для изготовления каркасов. Этот протокол демонстрирует изготовление, очистку, лиофилизацию, фотосборку и 3D-биопечать желатиновых метакрилоиловых или гидрогелевых микрочастиц GelMA. GelMA представляет собой фотохимически сшиваемый биополимер на основе белка, содержащий клеточный клей и биоразлагаемые фрагменты, который широко используется в качестве клеточно-чувствительного и поучительного биоматериала.
По сравнению с обычным сыпучим гидрогелем, гранулированные гидрогелевые каркасы GelMA являются микропористыми, что обеспечивает быструю инфильтрацию клеток, которая может быть адаптирована к размеру строительного блока. Гранулированные гидрогелевые каркасы GelMA могут открыть новые возможности для 3D-биопечати толстых тканей, органов и заболеваний на дешевых платформах и регенеративной инженерии. Для начала добавьте 10 миллиграммов LAP к 10 миллилитрам DPBS, чтобы приготовить 0,1%-ный раствор фотоинициатора.
Защитите раствор от света, обернув его алюминиевой фольгой, и промаркируйте. Далее растворяют нужное количество GelMA в растворе фотоинициатора. Поместите раствор, обернутый алюминиевой фольгой, в духовку при температуре 37 градусов Цельсия на один час, чтобы получить прозрачный раствор.
Чтобы приготовить масляную фазу, сделайте 2%-ный биосовместимый раствор поверхностно-активного вещества в инженерной жидкости. Вставьте трубку Tygon во входные и выходные отверстия устройства PDMS, затем вставьте тупую иглу 25-го калибра в другой конец трубки Tygon для входных отверстий. Поместите устройство под микроскоп и поддерживайте тепло окружающей среды примерно при температуре 40 градусов по Цельсию с помощью фена или обогревателя.
Загрузите водные и масляные растворы в отдельные шприцы, подключенные к устройству. Запустите шприцевой насос для масляной фазы с расходом 160 микролитров в минуту. После того, как масло заполнит канал, начните водную фазу со скоростью 80 микролитров в минуту.
Проверьте образование капель под микроскопом. Соберите капли в контейнер и оцените их в камере визуализации с помощью оптической микроскопии. Держите капли при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи, защищая их от света, чтобы инициировать физическое сшивание микрогеля GelMA и преобразовать капли в стабильные микрогели.
Для реализации микроинженерного метода превращения эмульсии в порошок (MEtoP) собирайте физически сшитые микрогели в конструкционную жидкость с помощью термически прочных микроцентрифужных пробирок или криовиалов. Закройте открытую пробирку лабораторной салфеткой и скотчем. Замораживайте физически сшитые микрогели в жидком азоте в течение 10 минут, чтобы продолжить лиофилизацию.
После лиофилизации получится твердый порошок. Добавьте один миллилитр охлажденного 0,1% раствора фотоинициатора при четырех градусах Цельсия в лиофилизированный порошок, чтобы получить микрогелевые суспензии. Центрифугируйте вихревую смесь при 3 000 г в течение 15 секунд.
После отбрасывания надосадочной жидкости перенесите упакованную микрогелевую суспензию в форму с помощью пипетки с положительным смещением и подвергните ее воздействию света на длине волны 400 нанометров с интенсивностью 15 милливатт на квадратный сантиметр в течение 60 секунд, чтобы сформировать гранулированные гидрогелевые каркасы или GHS. Для получения 400 микрогелей суспензии добавьте равное количество ледяного раствора PFO, 20% в инженерной жидкости к физически сшитым микрогелям GelMA. Затем центрифугируйте вихревую смесь при 300 г в течение 15 секунд и удалите масляную фазу из микрогелей GelMA с помощью пипетки.
Затем добавьте 400 микролитров ледяного 0,1%-ного раствора фотоинициатора в микрогелевую суспензию. После центрифугирования вихревого раствора при 300 г в течение 15 секунд выбросьте масло. Повторите этапы добавления раствора фотоинициатора и центрифугирования, но на этот раз центрифугу на 3 000 г и выбросьте надосадочную жидкость упакованных микрогелей GelMA.
Перенесите упакованные микрогели GelMA в форму с последующим воздействием света для образования GHS. Добавьте 100 миллиграммов порошка нанотромбоцитов к трем миллилитрам ледяной сверхчистой воды, чтобы получить дисперсию наночастиц 3,33%. Энергично встряхните дисперсию в холодильнике с температурой четыре градуса Цельсия в течение 15 минут, чтобы отшелушить агрегированные наночастицы.
Правильно отслоенные наночастицы дают четкую дисперсию. Растворите 50 миллиграммов LAP в пяти миллилитрах ледяной сверхчистой воды, чтобы приготовить 1%-ный раствор фотоинициатора. Затем добавьте 333 микролитра 1%-ного раствора фотоинициатора в расслоенную дисперсию наночастиц и заверните ее в алюминиевую фольгу для защиты от окружающего света.
Встряхните смесь в течение одной минуты, чтобы смешать дисперсию наночастиц и фотоинициатор. Добавьте ледяной PFO, 20% в инженерной жидкости в физически сшитые микрогели GelMA в объемном соотношении один к одному. После центрифугирования вихревой смеси при 300 г в течение 15 секунд выбросьте масляную фазу, содержащую поверхностно-активное вещество.
Добавьте ледяную дисперсию наночастиц с добавлением LAP в промытые микрогели GelMA. После центрифугирования при 3 000 г в течение 15 секунд выбросьте оставшееся масло на дно и надосадочную дисперсию. Храните суспензию при температуре четыре градуса Цельсия, защищая ее от света алюминиевой фольгой в течение одного дня, чтобы получить продукт GelMA, наноинженерные гранулированные биочернила или NGB.
На следующий день загрузите NGB в трехмиллилитровый шприц. Запечатайте загруженный шприц колпачком и парапленкой и проведите импульсное центрифугирование при 200 г, чтобы удалить захваченный воздух. Перенесите биочернила в трехмиллилитровый картридж с помощью разъема замка Luer «мама-мама».
Снова ненадолго центрифугируйте картридж на 200 г, чтобы удалить захваченный воздух, и перед использованием поддерживайте NGB при четырех градусах Цельсия. Затем загрузите подготовленную суспензию клеток фибробластов мыши в трехмиллилитровый шприц. Соедините шприцы NGB и шприцы, загруженные клетками, с помощью разъема замка Луера «мама-мама», и аккуратно перемешайте содержимое, нажимая вперед и назад 40 раз.
Распечатайте NGB или NGB с ячейками с помощью соответствующего биопринтера со стандартным коническим соплом, загрузив сопло в печатающую головку объемом три миллилитра. Поддерживайте температуру печатного стола ниже 10 градусов по Цельсию и оптимизируйте такие параметры, как скорость и противодавление. Выберите нужный файл gcode или STL.
Затем выбирают подложку и тип насадки для пневматического трехмиллилитрового шприца, оснащенного стандартной конической насадкой. Откалибруйте биопринтер, следуя инструкциям по устройству, и начните печать, чтобы получить 3D-структуры. Технология MEtoP позволяет получить ресуспендируемый высушенный порошок микрогеля путем сублимационной сушки под низким давлением, защищая микрогели от агрегации и сильной деформации.
Изображения SEM показали, что высушенные микрочастицы GelMA с использованием этой технологии сохраняют свою сферическую форму после лиофилизации по сравнению с агрегацией, наблюдаемой при обычной лиофилизации. Характеристика микропор GelMA, GHS и NGB с высокомолекулярным флуоресцентным красителем показала взаимосвязанные микромасштабные пустотные пространства. Кроме того, флуоресцентное изображение, оцененное с использованием специально написанного сценария MATLAB, обнаружило поры.
Измерения доли пустот и эквивалентного диаметра медианных пор не показали существенной разницы, свидетельствующей о наличии и взаимосвязи микромасштабных пор в 3D-печатных каркасах с использованием NGB. Превосходство скаффолдов NGB над плотно и свободно упакованными микрогелями GelMA путем измерения длины висячей нити показало, что NGB имеет большую длину, чем упакованные микрогели. Неплотно упакованные микрогели не давали нитей.
Полый цилиндр был напечатан на 3D-принтере, и вся конструкция была подвергнута воздействию света для фотосшивания. Печатная структура была физически удерживаема, чтобы показать форму, точность и структурную целостность. Если каркас используется для биологической оценки, например, при биопечати с нагрузкой на клетки, не забудьте выполнить все шаги при определенных условиях в шкафу биологической безопасности.
Мы надеемся вывести на рынок использование гранулированных гидрогелевых каркасов в качестве недавно появившейся платформы биоматериала в биомедицине.
