Las micropartículas de hidrogel numérico de matriz extracelular o ECM se pueden usar como bloques de construcción para la fabricación de andamios. Este protocolo demuestra la fabricación, purificación, liofilización, ensamblaje fotográfico y bioimpresión 3D de micropartículas de gelatina de metacriloilo o hidrogel GelMA. GelMA es un biopolímero fotoquímico, reticulado, a base de proteínas que contiene adhesivo celular y restos biodegradables que ha sido ampliamente utilizado como un biomaterial instructivo y sensible a las células.
En comparación con el hidrogel a granel convencional, los andamios de hidrogel granular GelMA son microporosos, lo que permite una rápida infiltración celular que se puede adaptar según el tamaño del bloque de construcción. Los andamios de hidrogel granular GelMA pueden abrir nuevas oportunidades para la bioimpresión 3D de tejidos gruesos, órganos y enfermedades en plataformas baratas e ingeniería regenerativa. Para comenzar, agregue 10 miligramos de LAP a 10 mililitros de DPBS para preparar una solución de fotoiniciador al 0.1%.
Proteja la solución de la luz envolviéndola con papel de aluminio y etiquétela. A continuación, disuelva la cantidad deseada de GelMA en la solución del fotoiniciador. Coloque la solución envuelta en papel de aluminio en el horno de 37 grados centígrados durante una hora para obtener una solución transparente.
Para preparar la fase oleosa, haga una solución de surfactante biocompatible al 2% en el fluido de ingeniería. Inserte el tubo Tygon en las entradas y salidas del dispositivo PDMS, luego inserte una aguja roma de calibre 25 en el otro extremo del tubo Tygon para las entradas. Coloque el dispositivo bajo el microscopio y mantenga el ambiente caliente a aproximadamente 40 grados centígrados con un secador de pelo o un calentador de espacio.
Cargue las soluciones acuosa y de aceite en jeringas separadas conectadas al dispositivo. Arranque la bomba de jeringa para la fase oleosa con un caudal de 160 microlitros por minuto. Después de que el aceite llene el canal, comience la fase acuosa a 80 microlitros por minuto.
Verifique la formación de gotitas bajo el microscopio. Recoja las gotitas en un recipiente y evalúelas en la cámara de imágenes mediante microscopía óptica. Mantenga las gotitas a cuatro grados centígrados durante la noche mientras las protege de la luz para iniciar la reticulación física del microgel GelMA y convertir las gotitas en microgeles estables.
Para implementar el método de emulsión a polvo de microingeniería, MEtoP, recolecte los microgeles reticulados físicamente en el fluido de ingeniería utilizando tubos de microcentrífuga o crioviales térmicamente duraderos. Selle el tubo abierto con una toallita de laboratorio y cinta adhesiva. Congele los microgeles físicamente reticulados en nitrógeno líquido durante 10 minutos para proceder con la liofilización.
Después de la liofilización, se obtendrá un polvo sólido. Agregue un mililitro de solución fotoiniciadora enfriada al 0,1% a cuatro grados centígrados al polvo liofilizado para hacer suspensiones de microgel. Centrifugar la mezcla de vórtice a 3, 000 g durante 15 segundos.
Después de desechar el sobrenadante, transfiera la suspensión de microgel empaquetada a un molde usando una pipeta de desplazamiento positivo y expóngala a la luz a una longitud de onda de 400 nanómetros con una intensidad de 15 milivatios por centímetro cuadrado durante 60 segundos para formar andamios de hidrogel granular o GHS. Para 400 microlitros de suspensión de microgel, agregue una cantidad igual de solución de PFO helada, 20% en fluido de ingeniería a los microgeles GelMA físicamente reticulados. A continuación, centrifugar la mezcla de vórtice a 300 g durante 15 segundos y eliminar la fase oleosa de los microgeles GelMA mediante pipeteo.
Luego agregue 400 microlitros de solución fotoiniciadora helada al 0.1% a la suspensión de microgel. Después de centrifugar la solución de vórtice a 300 g durante 15 segundos, deseche el aceite. Repita los pasos de adición de solución fotoiniciadora y centrifugación, pero centrifugar a 3.000 g esta vez y desechar el sobrenadante de los microgeles GelMA envasados.
Transfiera los microgeles GelMA envasados a un molde, seguido de una exposición a la luz para formar el GHS. Agregue 100 miligramos de polvo de nanoplaquetas a tres mililitros de agua ultrapura helada para formar una dispersión de nanopartículas al 3,33%. Vortex la dispersión vigorosamente dentro de un refrigerador de cuatro grados centígrados durante 15 minutos para exfoliar las nanopartículas agregadas.
Las nanopartículas correctamente exfoliadas producen una clara dispersión. Disuelva 50 miligramos de LAP en cinco mililitros de agua ultrapura helada para preparar una solución madre de fotoiniciador al 1%. Luego agregue 333 microlitros de solución fotoiniciadora al 1% a la dispersión de nanopartículas exfoliadas y envuélvala en papel de aluminio para protegerla contra la luz ambiental.
Vortex la mezcla durante un minuto para mezclar la dispersión de nanopartículas y el fotoiniciador. Agregue PFO helado, 20% en fluido de ingeniería a los microgeles GelMA físicamente reticulados en una proporción de volumen de uno a uno. Después de centrifugar la mezcla de vórtice a 300 g durante 15 segundos, deseche la fase oleosa que contiene el surfactante.
Agregue la dispersión de nanopartículas suplementada con LAP helada a los microgeles GelMA lavados. Después de centrifugar a 3, 000 g durante 15 segundos, deseche el aceite restante en el fondo y la dispersión sobrenadante. Almacene la suspensión a cuatro grados centígrados mientras la protege de la luz con papel de aluminio durante un día para producir el producto GelMA biotinta granular de nanoingeniería o NGB.
Al día siguiente, cargue el NGB en una jeringa de tres mililitros. Selle la jeringa cargada con una tapa y una parapelícula, y realice una centrifugación por pulso a 200 g para eliminar el aire atrapado. Transfiera la biotinta a un cartucho de tres mililitros utilizando un conector Luer hembra-hembra.
Centrifugar el cartucho brevemente a 200 g de nuevo para eliminar el aire atrapado, y mantener el NGB a cuatro grados centígrados antes de su uso. A continuación, cargue la suspensión de células de fibroblastos murinos preparada en una jeringa de tres mililitros. Acople el NGB y las jeringas cargadas con células usando un conector Luer hembra-hembra, y mezcle el contenido suavemente empujando hacia adelante y hacia atrás 40 veces.
Imprima el NGB o NGB cargado de células utilizando una bioimpresora adecuada con una boquilla cónica estándar cargando la boquilla en el cabezal de impresión de tres mililitros. Mantenga la temperatura de la cama de impresión por debajo de 10 grados centígrados y optimice parámetros como la velocidad y la contrapresión. Seleccione el archivo gcode o STL deseado.
A continuación, seleccione el sustrato y el tipo de boquilla para una jeringa neumática de tres mililitros equipada con una boquilla cónica estándar. Calibre la bioimpresora utilizando las pautas del dispositivo y comience a imprimir para obtener las estructuras 3D. La tecnología MEtoP produjo polvo de microgel seco resuspendible mediante liofilización a baja presión al tiempo que protegía los microgeles de la agregación y la deformación severa.
Las imágenes SEM mostraron que las micropartículas secas de GelMA que utilizan esta tecnología conservan su forma esférica después de la liofilización en comparación con la agregación observada con la liofilización convencional. La caracterización de microporos de GelMA, GHS y NGB con un colorante de fluorescencia de alto peso molecular mostró los espacios vacíos de microescala interconectados. Además, la imagen de fluorescencia evaluada mediante un script de MATLAB escrito a medida detectó los poros.
Las mediciones de la fracción vacía y el diámetro equivalente de poro mediano no mostraron diferencias significativas que atestigüen la disponibilidad e interconectividad de los poros a microescala en los andamios impresos en 3D utilizando el NGB. La superioridad de los andamios NGB a los microgeles GelMA apretados y sueltos por la medición de la longitud del filamento colgante reveló que NGB tenía una longitud mayor que los microgeles empaquetados. Los microgeles sueltos no produjeron filamentos.
Se imprimió en 3D un cilindro hueco y toda la construcción se expuso a la luz para la reticulación. La estructura impresa se sostuvo físicamente para mostrar la forma, la fidelidad y la integridad estructural. Si el andamio se utiliza para la evaluación biológica, por ejemplo, en la bioimpresión cargada de células, recuerde realizar todos los pasos bajo ciertas condiciones, bajo el gabinete de seguridad biológica.
Esperamos descomercializar el uso de andamios de hidrogel granular como una plataforma de biomateriales recientemente surgida en biomedicina.
