使用胚胎海马神经元冷冻原液进行简单且可重复的低密度原代培养

大鼠胚胎神经元的冷冻储备已准备就绪，培养细胞不需要先进的技术。这种技术非常简单，您无需任何许可即可进行动物实验、安排定时怀孕的动物或解剖胚胎。神经元可以在其他培养容器中培养并应用于其他类型的实验。

例如，用于电生理实验的微电极阵列板。首先用每孔100微升聚-L-赖氨酸包被96孔微孔板。接下来，将板在 37 摄氏度下孵育过夜。

在孵育结束时，除去聚-L-赖氨酸溶液。用无菌水清洗板两次，用无补充的新鲜培养基清洗一次。将盘子放在外面晾干。

干燥的盘子可以在四摄氏度下包裹和储存长达一个月。要开始细胞接种，向包衣板中的每个孔中加入50微升培养基。用200微升灭菌水填充外围孔，并在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育板一小时。

从液氮罐中取出神经元冷冻瓶，并将其置于37摄氏度的加热块中以部分解冻其内容物。使用具有宽口径尖端的一毫升移液器，缓慢地将小瓶内容物滴入无菌的50毫升管中。用一毫升室温培养基冲洗空的冷冻瓶。

将冲洗溶液转移到含有细胞悬液的50毫升管中。接下来，将9毫升室温培养基滴加到50毫升管中，使体积增加到11毫升。使用血细胞计数器计数细胞后，将细胞悬液转移到储液器中。

现在，使用具有宽口径吸头的多通道移液器，将最终计数为1.0乘以10的细胞悬液分配到每孔的四个细胞中，放入包被的96孔板中。将神经元在37摄氏度下在5%二氧化碳下孵育一到两个小时。然后，用100微升预热培养基替换培养基，并在相同条件下再次孵育。

体外四天后，以每孔0.2微摩尔的终浓度加入胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷，以减少神经胶质细胞的生长。将板放回培养箱中。体外21天后，用感兴趣的药物治疗细胞。

为了保持阳性对照，在固定前，每孔用100微摩尔谷氨酸在37摄氏度下处理细胞10分钟。在进行免疫细胞化学研究之前，通过在每孔中用100微升多聚甲醛替换培养液来固定细胞20分钟。固定后，每孔用250微升磷酸盐缓冲盐水洗涤孔两次，每次五分钟。

在本研究中，神经元正常发育，无需更换培养基三周。免疫组织化学显示沿 MAP2 阳性树突有 drebrin 阳性树突棘。观察到drebrin簇密度对谷氨酸刺激的剂量依赖性降低。

在细胞悬液变得太热之前移植是非常重要的。滴加培养基对于避免渗透压突然变化也至关重要。