Замороженные запасы эмбриональных нейронов крыс готовы к использованию, и для культивирования клеток не требуется никаких передовых методов. Этот метод очень прост, и вам не нужно никакого разрешения на эксперименты на животных, организацию беременных животных или рассечение эмбрионов. Нейроны могут культивироваться в других культуральных сосудах и применяться для других типов экспериментов.
Например, микроэлектродные пластины массива для электрофизиологических экспериментов. Начните с покрытия 96-луночной микропластины 100 микролитами поли-L-лизина на скважину. Далее высиживают пластины на ночь при температуре 37 градусов по Цельсию.
В конце инкубации удаляют раствор поли-L-лизина. Дважды вымойте тарелки стерилизованной водой и один раз свежей питательной средой без добавок. Выложите тарелки сушиться.
Сухие тарелки можно заворачивать и хранить до одного месяца при четырех градусах Цельсия. Чтобы начать посев клеток, добавьте 50 микролитров питательной среды к каждой лунке в покрытых пластинах. Заполните периферийные колодцы 200 микролитрами стерилизованной воды и инкубируйте пластину в течение одного часа при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.
Извлеките криобазок нейрона из резервуара с жидким азотом и поместите его в тепловой блок с температурой 37 градусов Цельсия, чтобы частично разморозить его содержимое. Используя одномиллилитровую пипетку с широким наконечником отверстия, медленно перенесите содержимое флаконов по каплям в стерильную 50-миллилитровую трубку. Ополойте пустой криоканец одним миллилитром питательной среды комнатной температуры.
Переложите раствор для полоскания в 50-миллилитровую трубку, содержащую клеточную суспензию. Далее добавляют девять миллилитров культуральной среды комнатной температуры по каплям в 50-миллилитровую трубку, составляющую объем до 11 миллилитров. После подсчета клеток с помощью гемоцитометра перенесите клеточную суспензию в резервуар.
Теперь, используя многоканальную пипетку с широкими наконечниками отверстий, дозируйте клеточную суспензию с окончательным количеством 1,0 раз 10 до четырех ячеек на скважину в покрытую 96-луночную пластину. Инкубируйте нейроны в течение одного-двух часов при 37 градусах Цельсия под 5% углекислого газа. Затем заменить питательную среду 100 микролитрами предварительно нагретой питательной среды и снова инкубировать в тех же условиях.
Через четыре дня in vitro добавляют цитозин бета-D-арабинофуранозид в конечной концентрации 0,2 микромоляра на лунку для уменьшения роста глиальных клеток. Поместите тарелку обратно в инкубатор. Через 21 день in vitro обработайте клетки интересующими препаратами.
Для поддержания положительного контроля обрабатывайте клетки 100 микромоляльным глутаматом на лунку в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия перед фиксацией. Перед выполнением иммуноцитохимических исследований зафиксируйте клетки в течение 20 минут, заменив культуральный раствор 100 микролитрами параформальдегида в каждой лунке. После фиксации промывайте скважины дважды 250 микролитрами фосфатно-буферного соляного раствора на скважину в течение пяти минут каждая.
В настоящем исследовании нейроны развивались нормально без обмена питательной средой в течение трех недель. Иммуногистохимия выявила дребрин-положительные дендритные шипы вдоль MAP2-положительных дендритов. Наблюдалось дозозависимое снижение плотности кластера дребрина на фоне стимуляции глутамата.
Пересадка клеточной суспензии до того, как она станет слишком теплой, очень важна. Каплевидное добавление питательной среды также имеет решающее значение, чтобы избежать внезапного изменения осмолярности.
