배아 해마 뉴런의 냉동 재고를 사용한 쉽고 재현 가능한 저밀도 1차 배양

쥐 배아 뉴런의 냉동 된 주식은 사용할 준비가되어 있으며 세포를 배양하는 데 고급 기술이 필요하지 않습니다. 이 기술은 매우 쉽고 동물 실험, 임신 한 동물 배치 또는 배아 해부에 대한 허가가 필요하지 않습니다. 뉴런은 다른 배양 용기에서 배양되어 다른 유형의 실험에 적용될 수 있습니다.

예를 들어, 전기 생리 학적 실험을위한 미세 전극 어레이 플레이트. 먼저 96웰 마이크로플레이트를 웰당 100마이크로리터의 폴리-L-라이신으로 코팅합니다. 다음으로, 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

배양이 끝나면 폴리 -L- 라이신 용액을 제거하십시오. 멸균 된 물로 접시를 두 번, 보충제가없는 신선한 배양 배지로 한 번 씻으십시오. 접시를 꺼내 말리십시오.

드라이 플레이트는 섭씨 4도에서 최대 1 개월 동안 포장하여 보관할 수 있습니다. 세포 파종을 시작하려면 코팅된 플레이트의 각 웰에 50마이크로리터의 배양 배지를 추가합니다. 주변 웰을 200 마이크로 리터의 멸균 된 물로 채우고 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도에서 1 시간 동안 플레이트를 배양합니다.

액체 질소 탱크에서 뉴런 냉동 바이알을 제거하고 섭씨 37도의 열 블록에 넣어 내용물을 부분적으로 해동합니다. 넓은 보어 팁이있는 1 밀리리터 피펫을 사용하여 바이알 내용물을 멸균 된 50 밀리리터 튜브에 천천히 떨어 뜨립니다. 빈 냉동 바이알을 1밀리리터의 실온 배양 배지로 헹굽니다.

헹굼 용액을 세포 현탁액이 들어있는 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 9 밀리리터의 실온 배양 배지를 50 밀리리터 튜브에 적가하여 부피를 11 밀리리터로 구성한다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수 한 후 세포 현탁액을 저장소로 옮깁니다.

이제 넓은 보어 팁을 갖는 다중 채널 피펫을 사용하여 웰당 4개의 세포를 1.0배 10의 최종 카운트로 세포 현탁액을 코팅된 96-웰 플레이트에 분배합니다. 뉴런을 5% 이산화탄소의 밑에 섭씨 37도에 1 2 시간 동안 항성하십시오. 그런 다음 배양 배지를 예열 된 배양 배지 100 마이크로 리터로 교체하고 동일한 조건에서 다시 배양하십시오.

시험관 내에서 4 일 후, 시토신 베타 -D- 아라 비노 푸라 노 사이드를 웰 당 0.2 마이크로 몰의 최종 농도로 첨가하여 신경교 세포의 성장을 감소시킵니다. 접시를 인큐베이터에 다시 놓습니다. 시험관 내에서 21 일 후, 세포를 관심 약물로 치료하십시오.

양성 대조군을 유지하려면 고정하기 전에 섭씨 37도에서 10 분 동안 웰당 100 마이크로 몰 글루타메이트로 세포를 처리하십시오. 면역 세포 화학 연구를 수행하기 전에 배양 용액을 각 웰에 100 마이크로 리터의 파라 포름 알데히드로 교체하여 세포를 20 분 동안 고정하십시오. 고정 후, 웰당 250마이크로리터의 인산염 완충 식염수로 웰을 각각 5분 동안 두 번 세척한다.

본 연구에서는 3주 동안 배양액을 교환하지 않고 정상적으로 뉴런을 발달시켰다. 면역 조직 화학은 MAP2 양성 수상 돌기를 따라 드레 브린 양성 수지상 가시를 밝혀 냈습니다. 글루타메이트 자극에 대한 drebrin 클러스터 밀도의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.

너무 따뜻해지기 전에 세포 현탁액을 이식하는 것이 매우 중요합니다. 배양 배지를 적가하는 것도 삼투압의 급격한 변화를 방지하는 데 중요합니다.