使用初级培养的希波坎帕神经元来研究Axon初始片段的组装

此协议用于定量研究由于缺少巨型安基林-G而缺乏预组装 AIS 的希波坎地区神经元的轴向初始片段的组装和结构。首先，从产后解剖六到八只海马，一天大的幼崽在培养皿中带有HBSS介质。用解剖剪刀将海马切成小块，然后从菜中转移到15毫升的管子上。

用五毫升的 HBSS 两次清洗海马，洗净后将它们放在 4.5 毫升的 HBSS 中。将 0.5 毫升 2.5% 的 trypsin 添加到 4.5 毫升 HBSS 中，在 37 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟，每 5 分钟倒管一次。消化良好的海马应该变得粘稠，并形成一个集群。

如果需要，再延长消化五分钟。每次洗三次HBSS清洗海马，每次洗五分钟。洗涤后，加入两毫升的 HBSS 和移液器海马上下用巴斯德移液器 15 次。

用火抛光的巴斯德移液器将组织修剪10次，将管子休息5分钟，直到所有块都固定在底部。重复与剩余块的三次，直到他们中的大多数已经消失。然后，使用一毫升移液器尖端将含有分离神经元的超自然体轻轻地转移到电镀盘上。

直接将其添加到预孵化电镀介质中，轻轻摇动板。播种后两到四个小时，用光显微镜检查电镀盘。大多数神经元应该附着在盖滑上。

使用细尖钳，翻转盖滑到胶质细胞馈线盘包含预先条件的神经元培养介质与蜡点侧朝下。神经元可以在胶质细胞喂食器中生长长达一个月。每七天用一毫升新鲜神经元培养介质喂养神经元。

在体外的第三天，翻转盖滑与蜡点侧朝上进入一个胶质细胞馈线盘与条件神经元培养介质。将 0.25 微克 CRE BFP DNA 与 0.5 微克安基林-G GFP DNA 混合在 1.7 毫升管中，以传输四个盖片。最佳添加 100 微升。

然后混合管子，放在架子上。如果只有CRE BFP被转染，GFP质子骨干用于匹配DNA的总量。将三微升的变异试剂与 100 微升最佳菌液混合在一个新的 1.7 毫升管中，并在室温下孵育管 5 分钟。

然后，将先前混合的DNA中的100微升与100微升的转染试剂混合，并将其放在架子上5至10分钟。通过在不接触盖条的情况下插入介质正下方的尖端，在每个盖滑的顶部添加 50 微升 DNA 组合。派珀特缓慢，以避免传播DNA混合物。

慢慢地将菜带回孵化器，并留在那里30至45分钟。翻转盖滑回家庭胶质喂食盘与蜡点侧朝下，并把菜回到孵化器。对于 AIS 定量，请打开斐济的 Z 系列图像，并生成图像的最大投影。

从图像中减去空盖滑动背景信号后，沿 AIS 画一条线，确保线的宽度完全覆盖 AIS。在AIS信号在背景上方升起之前启动线路，并在它下降到后台后停止。测量沿线的平均像素强度，并将其导入电子表格。

然后，运行 MATLAB 脚本以生成最终数字。实验应包括Cre-BFP仅将转染为负控制，Cre-BFP加480千达顿安基林-G共传递作为正对照，以及非转染条件作为技术控制。在Cre-BFP中，受感染的神经元缺乏AIS标记物的积累，包括安基林-G、β4光谱素、神经法辛和电压门控钠通道。

相比之下，Cre 和 480 千达顿安基林-G 共同传输的神经元已完全组装 AIS，AIS 标记的存在就证明了这一点。重要的是要通过与非变质菜肴的比较来确认文化的质量。不健康的神经元往往显示异常的AIS结构，如停产或异位AIS。

为了评估安基林-G人类神经发育障碍突变如何影响AIS组装，平均AIS强度绘制从索马到心斧。AIS 富集的蛋白质通常显示来自近轴的信号的快速增加和向离散轴发出的信号的缓慢减少。当与未变形 AIS 对齐时，突变曲线更宽，曲线峰值较低，表明 AIS 的结构变化。

野生类型安基林-G组装AIS与未受感染的AIS紧密对齐。