废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量和全基因组表征

基于废水的流行病学目前用于通过检测废水样本中的病毒RNA和识别潜在的疫情来补充全球COVID-19控制策略。该技术提供了我们社区中 COVID-19 流行率的全人群快照，其中包括无症状病例。空气采样也是该协议的重要补充。

临床诊断仍然是管理疾病暴发和大流行的最准确方法。但是，这种技术仍然可以作为它的补充。这种方法有许多步骤和关键点。

视觉演示是必不可少的，因为它将允许不太熟悉分子生物学的实验室复制该程序。首先，收集一升 24 小时复合废水样本。将 20 微升月经病毒加标到 70 毫升样品中。

将样品以700G离心10分钟后，使用离心超滤装置通过离心浓缩所得上清液，截止为10千道尔顿。通过以700G离心40分钟洗脱浓缩液，并颠倒超滤装置的位置。使用所得浓缩物进行RNA提取。

要收集空气样品，请在开始收集之前将无菌锥放入空气采样器中。采样结束后，使用商业病毒 RNA 提取试剂盒或内部方法从锥体的洗涤 PBS 中提取 RNA。在试剂设置室的干净罩中为每个靶标、门病毒、SARS-CoV-2、N1 和 N2 基因准备反应预混液。

通过倒置五次或脉冲涡旋混合引物 - 探针混合物和酶。将微量离心管放在冷架中，将 15 微升混合物分配到条状 PCR 管或放置在冷却架上的 96 孔 PCR 板中。盖上板，移至核酸处理区。

轻轻涡旋提取的RNA的等分试样五秒钟。将 5 微升 RNA 移液到反应混合物中，制成 25 微升并开始 RT-qPCR。在PCR板中，将每个样品的16微升移液至其在板上的位置，并加入4微升的5倍逆转录或RT预混液。

然后开始PCR反应。接下来，准备每组引物的 10 微摩尔稀释液和每组引物的预混液。在新的PCR板中，吸取20微升预混液，然后向每种混合物中吸取5微升RT样品。

盖上板后，开始PCR反应。PCR结束后，以1000 G的浓度旋转板15至30秒。对于PCR纯化，向每个孔中加入50微升基于微球的试剂，并通过移液混合以进行磁分离。

从磁性支架上取下板。用 15 微升 PCR 级水重悬每个沉淀，并将板在室温下孵育两分钟。将板放回磁性支架上，让珠子沉淀两分钟。

然后小心地将每个样品中的15微升上清液移液到新的PCR板中。接下来，对于文库制备，向每个样品中加入 1.75 微升来自 DNA 文库制备试剂盒的反应缓冲液和 0.75 微升酶混合物。短暂涡旋覆盖的板，并以 1000G 的速度旋转 15 至 30 秒。

在 21 摄氏度下孵育 5 分钟，在 65 摄氏度下孵育 5 分钟。将每个样品的3微升PCR级水移液到新的PCR板中。加入 0.75 微升制备的样品和 1.25 微升条形码用于测序文库制备。

然后加入 5 微升 T4 DNA 连接酶预混液，并通过移液充分混合。在离心机中旋转板后，将板在 21 摄氏度下孵育 20 分钟，在 65 摄氏度下孵育 10 分钟。合并所有样品后，向池中加入 192 微升基于微球的试剂进行 PCR 纯化。

通过移液充分混合，并在室温下孵育 10 分钟。将试管放在磁性支架上。等待上清液澄清并形成珠子沉淀。

从磁性支架上取下上清液和试管。加入 700 μL 短片段缓冲液或 SFB，并通过移液混合。将试管放回磁性支架上，等待颗粒形成和液体清除。

用移液管弃去上清液。向试管中加入 35 微升 PCR 级水，通过移液混合并在室温下孵育 2 分钟。将试管放在磁性支架上，让珠子沉淀，液体澄清。

将35微升上清液移液到新管中。接下来，按照文本手稿中的说明制备接头连接反应混合物，并在室温下孵育 10 分钟。将 20 微升微球基试剂混合到连接反应混合物中以进行 PCR 纯化，并在室温下孵育 10 分钟。

将试管放在磁性支架上，等待珠子沉淀形成，上清液变为无色。通过移液小心地弃去上清液。将 125 微升 SFB 混合到试管中，然后将其放回磁性支架上以分离珠子。

当液体变清时，弃去上清液并重复添加SFB，如前所述。将磁性支架上的管子打开打开 30 秒。加入 15 微升洗脱缓冲液，通过移液充分混合。

短暂旋转并在室温下孵育五分钟后，放在磁性支架上两分钟。将 15 微升上清液移液到新的低结合管中，用荧光 DNA 定量试剂盒测量浓度。接下来，将流通池插入实时 DNA 和 RNA 测序设备中。

将设置为 1， 000 微升的移液器的吸头插入灌注口。转动音量设置轮增大音量，直到看到吸头中的液体，然后丢弃吸头。将 800 微升的灌注混合物加入无气泡的灌注端口，等待 5 分钟。

将 200 微升文库混合物移液到灌注端口中。关闭盖板端口和灌注端口。在软件中开始测序实验，选择碱基调用，该方法检测并定量废水和空气样品中的SARS-CoV-2 RNA。

废水样品标准差为1.91%-13.98%，每升3.05倍10-2.83倍10-8个基因拷贝数不等。空气样品的范围从6.17乘以10到3到5.48乘以10到9，重复的标准偏差在0.54%和10.95%之间如本协议所述，对样品进行测序，这里总结了三个测序样品结果的示例。在所有三个样本中，谱系BA.5。

x 被 Freyja 工具指定为最普遍的。废水样品的浓度是一个关键步骤，因为废水中病毒RNA的浓度很低。因此，这一步是准确检测和定量的基础。

该程序可以通过在RT-qPCR方案中使用不同的引物来调整，用于检测和定量其他感染因子。该技术准确定量了废水和空气样本中的SARS-CoV-2。可以从不同的位置检测和定量不同的病原体。