A epidemiologia baseada em águas residuais é actualmente usada para complementar as estratégias de controlo COVID-19 em todo o mundo, detectando o RNA viral em amostras de águas residuais e identificando surtos potenciais. Esta técnica fornece um retrato populacional da prevalência de COVID-19 em nossa comunidade, que inclui casos assintomáticos. A amostragem de ar também é uma adição importante a este protocolo.
O diagnóstico clínico ainda é a maneira mais precisa de gerenciar surtos de doenças e pandemias. No entanto, essa técnica ainda é útil como complemento. Este método tem muitas etapas e pontos críticos.
Uma demonstração visual é essencial, pois permitirá que laboratórios não tão familiarizados com a biologia molecular repliquem o procedimento. Para começar, colete um litro de uma amostra de águas residuais compostas 24 horas. Spike 20 microlitros de mengovírus em 70 mililitros da amostra.
Após centrifugar a amostra a 700G por 10 minutos, concentrar o sobrenadante resultante usando um dispositivo centrífugo de ultrafiltração com um ponto de corte de 10 quilodaltons por centrifugação. Eluir o concentrado centrifugando a 700G por 40 minutos e invertendo a posição do aparelho de ultrafiltração. Use o concentrado resultante para extração de RNA.
Para coletar as amostras de ar, coloque um cone estéril no amostrador de ar antes de iniciar a coleta. Uma vez terminada a amostragem, extraia o RNA do PBS lavado do cone usando um kit comercial de extração de RNA viral ou um método interno. Prepare a mistura mestre de reação para cada alvo, mengovírus, genes SARS-CoV-2, N1 e N2 em uma capa limpa na sala de configuração do reagente.
Misture a mistura de primers-sonda e a enzima invertendo cinco vezes ou pulsando vórtice. Mantendo os tubos de microcentrífuga em uma cremalheira fria, distribua 15 microlitros da mistura em tubos de PCR de tiras ou uma placa de PCR de 96 poços colocada em um rack de resfriamento. Tampe a placa e mova-a para a área de manipulação de ácido nucleico.
Vencilhe suavemente uma alíquota do RNA extraído por cinco segundos. Pipetar cinco microlitros do RNA para a mistura de reação para fazer 25 microlitros e iniciar o RT-qPCR. Em uma placa de PCR, pipetar 16 microlitros de cada amostra para sua posição na placa, e adicionar quatro microlitros de cinco vezes transcrição reversa ou RT master mix.
Em seguida, inicie a reação de PCR. Em seguida, prepare 10 diluições micromolares de cada conjunto de primers e a mistura mestre para cada conjunto de primers. Em uma nova placa de PCR, pipetar 20 microlitros da mistura mestra, em seguida, cinco microlitros da amostra RT para cada mistura.
Após cobrir a placa, inicie a reação de PCR. Quando o PCR terminar, gire a placa a 1000 G por 15 a 30 segundos. Para a purificação por PCR, adicione 50 microlitros de reagente à base de grânulos em cada poço e misture por pipetagem para prosseguir com a separação magnética.
Retire a placa do suporte magnético. Ressuspenda cada pellet com 15 microlitros de água grau PCR e incube a placa à temperatura ambiente por dois minutos. Coloque a placa de volta no suporte magnético e deixe as contas pastilhas por dois minutos.
Em seguida, pipetar cuidadosamente 15 microlitros do sobrenadante de cada amostra para uma nova placa de PCR. Em seguida, para a preparação da biblioteca, adicione 1,75 microlitros de tampão de reação do kit de preparação da biblioteca de DNA e 0,75 microlitros de mistura enzimática a cada amostra. Vórtice brevemente a placa coberta e gire para baixo a 1000G por 15 a 30 segundos.
Incubar por cinco minutos a 21 graus Celsius e cinco minutos a 65 graus Celsius. Pipetar três microlitros de água grau PCR para cada amostra para uma nova placa de PCR. Adicione 0,75 microlitros das amostras preparadas e 1,25 microlitros de códigos de barras para sequenciar a preparação da biblioteca.
Em seguida, adicione cinco microlitros de T4 DNA ligase master mix e misture bem por pipetagem. Depois de girar a placa na centrífuga, incube a placa a 21 graus Celsius por 20 minutos e a 65 graus Celsius por 10 minutos. Depois de reunir todas as amostras, adicione 192 microlitros de reagente à base de contas à piscina para purificação por PCR.
Misture bem por pipetagem e incube à temperatura ambiente durante 10 minutos. Coloque o tubo em um suporte magnético. Espere o sobrenadante clarear e uma pelota de contas se forme.
Remova o sobrenadante e o tubo do suporte magnético. Adicione 700 microlitros do tampão de fragmento curto ou SFB e misture por pipetagem. Coloque o tubo de volta no suporte magnético e espere que o pellet se forme e o líquido limpe.
Descarte o sobrenadante usando uma pipeta. Adicione 35 microlitros de água grau PCR ao tubo, misture por pipetagem e incube à temperatura ambiente durante dois minutos. Coloque o tubo no suporte magnético e deixe as contas se amontoarem e o líquido clarear.
Pipetar 35 microlitros do sobrenadante para um novo tubo. Em seguida, prepare a mistura de reação de ligadura do adaptador, conforme descrito no manuscrito do texto, e incube à temperatura ambiente por 10 minutos. Misturar 20 microlitros do reagente à base de grânulos à mistura de reação de ligadura para purificação por PCR e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.
Coloque o tubo no suporte magnético e espere que o grânulo se forme e o sobrenadante fique incolor. Descarte cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem. Misture 125 microlitros de SFB no tubo e coloque-o novamente no suporte magnético para separar as contas.
Quando o líquido ficar límpido, descarte o sobrenadante e repita a adição de SFB como demonstrado anteriormente. Deixe o tubo no suporte magnético aberto por 30 segundos. Adicione 15 microlitros do tampão de eluição e misture bem por pipetagem.
Após uma breve rotação para baixo e incubação à temperatura ambiente por cinco minutos, coloque no suporte magnético por dois minutos. Pipetar 15 microlitros do sobrenadante em um novo tubo de baixa ligação para medir a concentração com um kit de quantificação de DNA fluorométrico. Em seguida, insira a célula de fluxo no dispositivo de sequenciamento de DNA e RNA em tempo real.
Insira a ponta de uma pipeta de 1.000 microlitros ajustada para 200 microlitros na porta de escorvamento. Gire a roda de ajuste de volume para aumentar o volume até ver o líquido na ponta e, em seguida, descarte a ponta. Adicione 800 microlitros da mistura de escorvamento ao portador de escorvamento sem bolhas e aguarde cinco minutos.
Pipeta 200 microlitros da biblioteca misturam-se na porta de escorvamento. Feche a porta de tampa e a porta de escorvamento. Inicie o experimento de sequenciamento no software e selecione Base Calling On.Este método detectou e quantificou o RNA do SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais e ar.
As amostras de esgoto apresentaram desvio padrão de 1,91% a 13,98% entre as triplicatas, variando de 3,05 vezes 10 a três a 2,83 vezes 10 a oito cópias gênicas por litro. As amostras de ar variaram de 6,17 vezes 10 a três a 5,48 vezes 10 a nove, com desvio padrão nas duplicatas entre 0,54% e 10,95%Conforme descrito neste protocolo, as amostras foram sequenciadas, e um exemplo de três resultados de amostras sequenciadas é resumido aqui. Nas três amostras, a linhagem BA.5.
x foi atribuído como o mais prevalente pela ferramenta de Freyja. A concentração de amostras de águas residuárias é uma etapa crucial, uma vez que o RNA viral está presente em baixas concentrações nas águas residuárias. E por isso essa etapa é fundamental para a detecção e quantificação precisas.
Este procedimento pode ser adaptado utilizando diferentes primers no protocolo RT-qPCR para ser usado para detectar e quantificar outros agentes infecciosos. A técnica quantificou com precisão o SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais e ar. Diferentes patógenos podem ser detectados e quantificados a partir de diferentes locais.
