Die abwasserbasierte Epidemiologie wird derzeit weltweit eingesetzt, um COVID-19-Kontrollstrategien zu ergänzen, indem virale RNA in Abwasserproben nachgewiesen und potenzielle Ausbrüche identifiziert werden. Diese Technik liefert eine bevölkerungsweite Momentaufnahme der Prävalenz von COVID-19 in unserer Gemeinschaft, einschließlich asymptomatischer Fälle. Auch die Luftprobenahme ist eine wichtige Ergänzung zu diesem Protokoll.
Die klinische Diagnostik ist nach wie vor der genaueste Weg, um Krankheitsausbrüche und Pandemien zu bewältigen. Diese Technik ist jedoch immer noch als Ergänzung dazu nützlich. Diese Methode hat viele Schritte und kritische Punkte.
Eine visuelle Demonstration ist unerlässlich, da sie es Laboratorien ermöglicht, die mit der Molekularbiologie nicht so vertraut sind, das Verfahren zu replizieren. Sammeln Sie zunächst einen Liter einer 24-Stunden-Mischwasserprobe. Spicken Sie 20 Mikroliter Mengovirus in 70 Milliliter der Probe.
Nachdem die Probe 10 Minuten lang bei 700 g zentrifugiert wurde, wird der resultierende Überstand mit einer zentrifugalen Ultrafiltrationsvorrichtung mit einem Cutoff von 10 Kilodalton durch Zentrifugation konzentriert. Eluieren Sie das Konzentrat, indem Sie es 40 Minuten lang bei 700 g zentrifugieren und die Position des Ultrafiltrationsgeräts umkehren. Verwenden Sie das resultierende Konzentrat für die RNA-Extraktion.
Um die Luftproben zu sammeln, legen Sie einen sterilen Kegel in den Luftkeimsammler, bevor Sie mit der Entnahme beginnen. Sobald die Probenahme abgeschlossen ist, extrahieren Sie die RNA aus dem gewaschenen PBS des Kegels mit einem kommerziellen viralen RNA-Extraktionskit oder einer internen Methode. Bereiten Sie den Reaktions-Mastermix für jedes Ziel-, Mengovirus-, SARS-CoV-2-, N1- und N2-Gen in einer sauberen Haube im Reagenzien-Setup-Raum vor.
Mischen Sie die Primer-Sonden-Mischung und das Enzym durch fünfmaliges Invertieren oder Pulswirbeln. Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Kühlregal und geben Sie 15 Mikroliter der Mischung in Streifen-PCR-Röhrchen oder eine 96-Well-PCR-Platte, die auf einem Kühlgestell platziert wird. Decken Sie die Platte ab und bewegen Sie sie in den Nukleinsäure-Handhabungsbereich.
Ein Aliquot der extrahierten RNA wird fünf Sekunden lang vorsichtig vortexen. Pipettieren Sie fünf Mikroliter der RNA in die Reaktionsmischung, um 25 Mikroliter zu erhalten, und starten Sie die RT-qPCR. In einer PCR-Platte werden 16 Mikroliter jeder Probe an ihre Position auf der Platte pipettiert und vier Mikroliter fünffacher reverser Transkription oder RT-Mastermix hinzugefügt.
Starten Sie dann die PCR-Reaktion. Bereiten Sie als Nächstes 10 mikromolare Verdünnungen jedes Primer-Sets und die Master-Mischung für jeden Primer-Satz vor. In eine neue PCR-Platte pipettieren Sie 20 Mikroliter der Mastermischung und dann fünf Mikroliter der RT-Probe in jede Mischung.
Nachdem Sie die Platte abgedeckt haben, starten Sie die PCR-Reaktion. Sobald die PCR abgeschlossen ist, schleudern Sie die Platte bei 1000 g für 15 bis 30 Sekunden herunter. Für die PCR-Aufreinigung werden 50 Mikroliter Reagenz auf Bead-Basis in jede Vertiefung gegeben und durch Pipettieren gemischt, um mit der magnetischen Trennung fortzufahren.
Entfernen Sie die Platte vom magnetischen Ständer. Resuspendieren Sie jedes Pellet mit 15 Mikrolitern Wasser in PCR-Qualität und inkubieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Platte wieder auf den magnetischen Ständer und lassen Sie die Perlen zwei Minuten lang pelletieren.
Anschließend werden vorsichtig 15 Mikroliter des Überstandes von jeder Probe auf eine neue PCR-Platte pipettiert. Als nächstes fügen Sie für die Bibliotheksvorbereitung 1,75 Mikroliter Reaktionspuffer aus dem DNA-Bibliotheksvorbereitungskit und 0,75 Mikroliter Enzymmischung zu jeder Probe hinzu. Die abgedeckte Platte kurz vortexen und bei 1000 G für 15 bis 30 Sekunden herunterschleudern.
Fünf Minuten bei 21 Grad Celsius und fünf Minuten bei 65 Grad Celsius inkubieren. Pipettieren Sie drei Mikroliter Wasser in PCR-Qualität für jede Probe auf eine neue PCR-Platte. Fügen Sie 0,75 Mikroliter der vorbereiteten Proben und 1,25 Mikroliter Barcodes für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek hinzu.
Geben Sie dann fünf Mikroliter T4-DNA-Ligase-Mastermix hinzu und mischen Sie ihn durch Pipettieren gut. Nachdem Sie die Platte in der Zentrifuge heruntergedreht haben, inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei 21 Grad Celsius und 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Nachdem Sie alle Proben gepoolt haben, geben Sie 192 Mikroliter Reagenz auf Perlbasis zur PCR-Aufreinigung in den Pool.
Durch Pipettieren gut mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Stellen Sie das Röhrchen auf einen magnetischen Ständer. Warten Sie, bis sich der Überstand verzogen hat und sich ein Kügelchenpellet gebildet hat.
Entfernen Sie den Überstand und das Röhrchen vom magnetischen Ständer. 700 Mikroliter des kurzen Fragmentpuffers oder SFB zugeben und durch Pipettieren mischen. Setzen Sie das Röhrchen wieder auf den magnetischen Ständer und warten Sie, bis sich das Pellet gebildet hat und die Flüssigkeit verschwunden ist.
Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Geben Sie 35 Mikroliter Wasser in PCR-Qualität in das Röhrchen, mischen Sie es durch Pipettieren und inkubieren Sie es zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie das Röhrchen auf den magnetischen Ständer und lassen Sie die Perlen pelletieren und die Flüssigkeit klären.
35 Mikroliter des Überstandes in ein neues Röhrchen pipettieren. Als nächstes wird die Adapter-Ligation-Reaktionsmischung wie im Textmanuskript beschrieben hergestellt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Mischen Sie 20 Mikroliter des Reagenzes auf Kügelchenbasis mit der Ligationsreaktionsmischung für die PCR-Aufreinigung und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Legen Sie das Röhrchen auf den magnetischen Ständer und warten Sie, bis sich das Kügelchenpellet gebildet hat und der Überstand farblos geworden ist. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren. Mischen Sie 125 Mikroliter SFB in das Röhrchen und legen Sie es wieder auf den magnetischen Ständer, um die Perlen zu trennen.
Wenn die Flüssigkeit klar wird, verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Zugabe von SFB, wie zuvor gezeigt. Lassen Sie das Röhrchen auf dem magnetischen Ständer 30 Sekunden lang geöffnet. Geben Sie 15 Mikroliter des Elutionspuffers hinzu und mischen Sie ihn durch Pipettieren gut.
Nach einem kurzen Schleudern und einer Inkubation bei Raumtemperatur für fünf Minuten auf den magnetischen Ständer stellen. Pipettieren Sie 15 Mikroliter des Überstandes in ein neues Röhrchen mit geringer Bindung, um die Konzentration mit einem fluorometrischen DNA-Quantifizierungskit zu messen. Als nächstes wird die Durchflusszelle in das Echtzeit-DNA- und RNA-Sequenzierungsgerät eingesetzt.
Führen Sie die Spitze einer 1.000-Mikroliter-Pipette mit einem Fassungsvermögen von 200 Mikrolitern in den Ansauganschluss ein. Drehen Sie das Lautstärkeeinstellrad, um die Lautstärke zu erhöhen, bis die Flüssigkeit in der Spitze zu sehen ist, und entsorgen Sie dann die Spitze. Geben Sie 800 Mikroliter der Ansaugmischung blasenfrei in den Ansauganschluss und warten Sie fünf Minuten.
Pipettieren Sie 200 Mikroliter der Bibliotheksmischung in den Priming-Port. Schließen Sie die Abdeckungsöffnung und die Ansaugöffnung. Starten Sie das Sequenzierungsexperiment in der Software und wählen Sie Base Calling On.Mit dieser Methode wurde SARS-CoV-2-RNA in Abwasser- und Luftproben nachgewiesen und quantifiziert.
Die Abwasserproben wiesen eine Standardabweichung von 1,91 % bis 13,98 % zwischen den Dreifachen auf und reichten von 3,05 mal 10 bis zu den drei bis 2,83 mal 10 bis zu den acht Genkopien pro Liter. Die Luftproben reichten von 6,17 mal 10 bis zu den drei bis 5,48 mal 10 bis neun, wobei die Standardabweichung in den Duplikaten zwischen 0,54 % und 10,95 % lag. Wie in diesem Protokoll beschrieben, wurden die Proben sequenziert, und ein Beispiel für drei sequenzierte Probenergebnisse ist hier zusammengefasst. In allen drei Proben wurde die Abstammungslinie BA.5.
x wurde vom Freyja-Tool als am weitesten verbreitetes zugewiesen. Die Konzentration von Abwasserproben ist ein entscheidender Schritt, da virale RNA in geringen Konzentrationen im Abwasser vorhanden ist. Daher ist dieser Schritt von grundlegender Bedeutung für eine genaue Detektion und Quantifizierung.
Dieses Verfahren kann durch die Verwendung verschiedener Primer im RT-qPCR-Protokoll angepasst werden, die zum Nachweis und zur Quantifizierung anderer Infektionserreger verwendet werden. Die Technik quantifizierte SARS-CoV-2 in Abwasser- und Luftproben genau. Unterschiedliche Erreger können von unterschiedlichen Stellen aus nachgewiesen und quantifiziert werden.
